Ri質(zhì)粒介導(dǎo)fps基因轉(zhuǎn)化煙草的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Ri質(zhì)粒介導(dǎo)fps基因轉(zhuǎn)化煙草，經(jīng)過(guò)PCR、PCR-Southern、Northern-blot檢測(cè)，獲得了四株fps轉(zhuǎn)基因發(fā)根；對(duì)轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根在固體、液體培養(yǎng)條件下進(jìn)行生長(zhǎng)特性研究，并且將發(fā)根株系3在生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)，顯示了利用發(fā)狀根的生產(chǎn)潛能；用粗毒素對(duì)轉(zhuǎn)基因發(fā)根進(jìn)行誘導(dǎo)，提取其浸提液進(jìn)行抗病實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)果表明對(duì)赤星病、黑脛病具有明顯的抗性，這為生產(chǎn)安全、高效的生物農(nóng)藥提供可能途徑。主要結(jié)果如下：1.本研究采用凍融法進(jìn)

2、行pBiARfps質(zhì)粒轉(zhuǎn)化野生型Ar1334，獲得Ar1334工程菌株；利用Ar1334工程菌轉(zhuǎn)化煙草K326，獲得煙草發(fā)狀根，以Ri質(zhì)粒T-DNA上與發(fā)根相關(guān)的rolC基因設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)發(fā)狀根進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了560bp的目的基因片段，證明了Ri質(zhì)粒T-DNA在煙草發(fā)狀根的基因組中得到了整合；以fps基因設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)發(fā)狀根進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了1000bp的目的基因片段，證明了fps基因在煙草發(fā)狀根的基因組中得到整合；利用

3、地高辛標(biāo)記fps基因探針，對(duì)fps基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR-Southern檢測(cè)，并且檢測(cè)到了目的基因片段的印跡，證明fps基因在發(fā)狀根基因組分子水平得到了表達(dá)；用發(fā)狀根基因組RNA進(jìn)行Northern-blot檢測(cè)，也檢測(cè)到了目的基因片段印跡，證明fps基因發(fā)狀根基因組轉(zhuǎn)錄水平得到表達(dá)。從而獲得了fps基因煙草發(fā)狀根。 2.煙草發(fā)狀根在固體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，四個(gè)轉(zhuǎn)基因株系除具有發(fā)狀根的一般特性外，還有其各自形態(tài)上的特性；在液體懸浮培

4、養(yǎng)條件下，對(duì)轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的生長(zhǎng)特性研究結(jié)果表明，煙草轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根呈典型的S型生長(zhǎng)曲線，生長(zhǎng)周期為30d，生物量的積累在株系間表現(xiàn)比較大的差異，生長(zhǎng)最好的株系4生物量達(dá)到45.6g/l，最差的株系3也達(dá)到18.9g/l；我們將株系3轉(zhuǎn)到生長(zhǎng)條件更好的生物反應(yīng)器中進(jìn)行放大培養(yǎng)，結(jié)果表明接種，2g/l生物量的發(fā)狀根，培養(yǎng)一個(gè)周期后，長(zhǎng)滿整個(gè)生物反應(yīng)器，生物量達(dá)到94.7g/l，干重達(dá)到9.6g/l，進(jìn)一步顯示了利用發(fā)狀根發(fā)大培養(yǎng)生產(chǎn)有用次生代

5、謝物的生產(chǎn)潛能。 3.用粗毒素誘導(dǎo)培養(yǎng)25d左右的轉(zhuǎn)基因煙草發(fā)狀根，再利用其浸提液進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)基因發(fā)根抗菌性明顯優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因發(fā)根，株系間也表現(xiàn)明顯的差異，株系3在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出其抗菌優(yōu)勢(shì)；為了實(shí)際應(yīng)用中得到可靠的證據(jù)，我們利用株系3浸提液進(jìn)行煙草幼苗抗黑脛病研究，結(jié)果表明：外施經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因煙草發(fā)狀根浸提液后，煙草幼苗抗菌性提高45％，進(jìn)一步說(shuō)明轉(zhuǎn)基因發(fā)根在粗毒素誘導(dǎo)后，激活了植保素的合成途徑，對(duì)病原菌的抗性增