人晶狀體細(xì)胞膜流動(dòng)性的年齡相關(guān)性改變及可溶性晶狀體蛋白的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、人的晶狀體是一個(gè)特殊的器官,其赤道部的晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells,LECs)不斷分化形成新的晶狀體纖維,并向核區(qū)移行,在此過(guò)程中纖維細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞器不斷退化消失,僅留下透明的細(xì)胞質(zhì),從而形成了幾乎不存在蛋白質(zhì)更新的核區(qū)。這一核區(qū)擔(dān)負(fù)著人眼調(diào)節(jié)的主要形變?nèi)蝿?wù),同時(shí)它又是翻譯后修飾的主要區(qū)域,雙重的負(fù)荷使其容易受到各種年齡效應(yīng)的影響。
　　隨著年齡的增長(zhǎng),晶狀體組織的硬度明顯增加,尤其是核區(qū),從而加

2、速了老視和年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生。由于晶狀體核區(qū)的含水量并未發(fā)生明顯的改變,這種硬度的增加與核區(qū)內(nèi)纖維的累積關(guān)系不大。研究表明,到了中年,人品狀體中50％原本可溶性的蛋白質(zhì)變得不溶,從而使晶狀體的硬度增加:而對(duì)紅細(xì)胞和膽管細(xì)胞的研究表明,隨著年齡的增長(zhǎng)其細(xì)胞膜的流動(dòng)性會(huì)不斷下降。
　　那么人品狀體細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生什么樣的年齡相關(guān)性改變呢,變的更致密還是流動(dòng)性增加?它的改變是不是也是晶狀體硬度增加的原因之一呢?本研究通過(guò)觀察分析人晶狀體

3、細(xì)胞膜流動(dòng)性的年齡相關(guān)性改變,探索促使其變化的可能原因,來(lái)明確這些疑問(wèn)。
　　第一部分人晶狀體細(xì)胞膜流動(dòng)性年齡相關(guān)性改變的研究
　　目的：觀察入晶狀體細(xì)胞膜流動(dòng)性的年齡相關(guān)性改變。
　　方法：23對(duì)人晶狀體,22-83歲。每對(duì)中一個(gè)品狀體制作冠狀位切片,取中央部位的切片進(jìn)行6-?；?2-二甲酰氨基萘(6-acyl-2-dimethylaminonapthalene,Laurdan)染色,并用雙光子共聚焦顯微鏡沿切片最長(zhǎng)

4、軸連續(xù)采集圖像,用軟件計(jì)算轉(zhuǎn)換得到GP(Generalized Polarization)圖,把來(lái)自同一切片的GP圖像用ImageJ-MosaicJ軟件組合后,分別測(cè)量中心點(diǎn)兩側(cè)距離為0.75,2,3,3.5,4,4.5mm處的GP值。每對(duì)中另一個(gè)晶狀體用模具解剖成外部、屏障部、內(nèi)部和核心部,進(jìn)行脂質(zhì)提取,并用質(zhì)譜分析每個(gè)部分的膽固醇含量。
　　結(jié)果：20-40歲時(shí),晶狀體從外到內(nèi)的細(xì)胞膜流動(dòng)性幾乎恒定;隨著年齡的增加,人晶狀體中

5、央的細(xì)胞膜流動(dòng)性逐漸增加,而距中心3.5mm以外的細(xì)胞膜流動(dòng)性改變不明顯。膽固醇的含量沒(méi)有明顯的年齡性或區(qū)域性改變。
　　結(jié)論：人晶狀體核區(qū)的細(xì)胞膜流動(dòng)性隨年齡增加而增加,這與膽固醇含量的變化并不相關(guān)。
　　第二部分人晶狀體細(xì)胞膜流動(dòng)性與可溶性晶狀體蛋白含量改變的相關(guān)性研究
　　目的：分析人晶狀體細(xì)胞膜流動(dòng)性與可溶性晶狀體蛋白含量改變的相關(guān)性。
　　方法：3對(duì)晶狀體,年齡分別為31,40,63歲,每對(duì)中的一個(gè)晶狀

6、體直接制作冠狀位切片,另一個(gè)晶狀體則在50℃:加熱20小時(shí)后制作冠狀位切片,切片的染色觀察如第一部分。所有切片后剩余的組織用模具解剖獲得核心部位組織,用凝膠過(guò)濾HPLC分析可溶性晶狀體蛋白含量。另取一對(duì)38歲的晶狀體,一個(gè)晶狀體用模具獲得直徑6mm以?xún)?nèi)的核組織,均分成5塊,另一個(gè)晶狀體進(jìn)行連續(xù)切片,以1塊組織和3個(gè)切片為一組,分別在50℃加熱0,4,8,16和24 h,分析可溶性晶狀體蛋白含量改變,并測(cè)量各組切片的GP值改變。
　

7、　結(jié)果：50℃加熱后,晶狀體內(nèi)部細(xì)胞膜流動(dòng)性顯著增加,同時(shí)α,α的高分子聚集物(high molecular weight,HMW)和β晶狀體蛋白的含量下降。隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng),晶狀體內(nèi)部的GP值呈現(xiàn)與可溶性晶狀體蛋白含量一致的下降。
　　結(jié)論：晶狀體細(xì)胞膜流動(dòng)性的改變與可溶性晶狀體蛋白含量的變化可能相關(guān)。
　　第三部分可溶性晶狀體蛋白與二氫鞘磷脂(dihydrosphingomyelin,DHSM)囊泡的結(jié)合實(shí)驗(yàn)
　

8、　目的：研究品狀體細(xì)胞膜流動(dòng)性與可溶性晶狀體蛋白是否存在直接聯(lián)系。
　　方法：用人晶狀體內(nèi)含量最高的磷脂成分DHSM制作0.1mg/ml囊泡溶液,并在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前1小時(shí)加入Laurdan標(biāo)記。分別配制12.5,5,2.5,1.25mg/ml的α,β,γ晶狀體蛋白溶液,各取10μL與240μL囊泡混合后,最終晶狀體蛋白濃度分別為0.5,0.2,0.1,0.05mg/ml,結(jié)合半小時(shí)后,用熒光計(jì)測(cè)量各組GP值變化。
　　結(jié)果：隨著