CIA動(dòng)物模型中不同治療方案對(duì)Th17-Treg細(xì)胞及IL-17表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的: 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是以關(guān)節(jié)炎癥和骨質(zhì)破壞為主要特征的自身免疫性疾病,致殘率很高,治療主要依賴于改善病情抗風(fēng)濕藥物的聯(lián)合使用,目前臨床上常用的聯(lián)合方案很多,不同治療方案在RA患者中的療效不同,但這些聯(lián)合治療方案在RA治療中發(fā)揮作用的機(jī)制尚不完全清楚。近年來的研究已經(jīng)明確:Th17與Treg細(xì)胞之間的失衡是導(dǎo)致RA發(fā)病的重要機(jī)制。那么不同聯(lián)合治療方案在臨床上發(fā)揮不同的作用是否與其對(duì) Th1

2、7與 Treg細(xì)胞平衡影響的不同呢?關(guān)于治療效果與Th17/Treg關(guān)系的研究較少,部分學(xué)者曾經(jīng)對(duì)部分單藥治療進(jìn)行過研究。甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)、柳氮磺吡啶(Sulfasalazin, SSZ)、硫酸羥氯喹(hydroxychloroquin, HCQ)、糖皮質(zhì)激素以及抗TNF-α的聯(lián)合治療是否可以調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡以及哪種聯(lián)合方案能更好的調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡目前尚無定論,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床試驗(yàn)間亦存在

3、差異。本研究旨在了解臨床常規(guī)治療方案對(duì)外周血IL-17表達(dá)的影響,明確治療效果與Th17/Treg表達(dá)的關(guān)系,為制定更加有效的治療方案提供依據(jù)。本課題開展了RA動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究,以闡明其聯(lián)合用藥機(jī)制。經(jīng) PUDMED、CNKI、萬方等檢索,國內(nèi)外尚未見有類似報(bào)道,為 RA的治療提供新思路和方法。本研究通過對(duì)RA動(dòng)物模型,即膠原誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎模型(collagen induced arthritis,CIA)的實(shí)驗(yàn)研究,從炎性細(xì)胞因子

4、、T淋巴細(xì)胞亞群平衡與細(xì)胞凋亡的角度,研究臨床常規(guī)治療的作用機(jī)制。
　　方法: 建立Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的雄性Wistar大鼠CIA模型,隨機(jī)分為CIA模型對(duì)照組、 MTX(2.7mg/kg/w)聯(lián)合潑尼松組(Pred:5mg/kg/day)、MTX(2.7mg/kg/w)聯(lián)合HCQ(40mg/kg/day)和SSZ(160mg/kg/day)、MTX(2.7mg/kg/w)聯(lián)合益賽普組(0.3mg/kg/day),另選8只健康大鼠作為正

5、常對(duì)照組。進(jìn)行21周體內(nèi)實(shí)驗(yàn),初次免疫后第3周開始給藥。治療過程中連續(xù)對(duì)大鼠的關(guān)節(jié)炎癥程度進(jìn)行評(píng)分,測量右后肢的踝關(guān)節(jié)的腫脹程度。治療21周后全部動(dòng)物處死,留取大鼠右后肢踝關(guān)節(jié),大鼠外周血2ml以及脾臟,大鼠踝關(guān)節(jié)經(jīng)固定、脫鈣、包埋后,制成切片,外周血經(jīng)離心留取血清,從脾臟中分離脾單核細(xì)胞。然后各組大鼠行 HE染色觀察踝關(guān)節(jié)滑膜的組織病理學(xué)改變,進(jìn)一步通過酶聯(lián)免疫吸附方法測定血清IL-17的水平,同時(shí)采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測Th17及Tre

6、g細(xì)胞亞群的數(shù)量及其凋亡。
　　結(jié)果:
　　1.CIA大鼠造模成功率達(dá)90.3％(56/62)。
　　2.關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI):各治療組AI較模型對(duì)照組均有明顯改善,MTX聯(lián)合潑尼松組優(yōu)于MTX聯(lián)合羥氯喹和柳氮磺吡啶組及MTX聯(lián)合益賽普組(P<0.05),
　　3.踝關(guān)節(jié)腫脹程度:在三個(gè)治療組中,MTX聯(lián)合潑尼松組的踝關(guān)節(jié)腫脹程度改善最明顯(P<0.05)。
　　4.體重:MTX聯(lián)合潑尼松組體重較其它各組明顯

7、減輕(P<0.05)。
　　5.踝關(guān)節(jié)病理:CIA模型組大鼠的大量炎性細(xì)胞浸潤,滑膜增生,排列紊亂,軟骨、骨組織嚴(yán)重侵蝕; MTX聯(lián)合羥氯喹和柳氮磺吡啶組滑膜炎癥、軟骨及骨組織侵蝕有所減輕(P<0.05); MTX聯(lián)合潑尼松組和MTX聯(lián)合益賽普組滑膜炎癥、軟骨及骨組織侵蝕明顯改善(P<0.05)。
　　6.血清IL-17水平在CIA模型對(duì)照組大鼠中水平最高,各治療組大鼠的IL-17水平均較對(duì)照組大鼠明顯降低(P<0.05)。

8、
　　7. Th17及Treg細(xì)胞亞群:
　　(1)在免疫后第10周,各治療組大鼠脾Treg細(xì)胞亞群數(shù)量較CIA模型對(duì)照組增加,同時(shí)Treg細(xì)胞凋亡減低,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　(2)在免疫后第21周,各治療組大鼠脾Th17細(xì)胞亞群數(shù)量較CIA模型對(duì)照組減少,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MTX聯(lián)合羥氯喹和柳氮磺吡啶組的Th17細(xì)胞亞群數(shù)量低于MTX聯(lián)合潑尼松組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0

9、.05)。
　　結(jié)論:
　　1.在CIA大鼠模型中:血清IL-17水平增高;Th17細(xì)胞亞群增多,凋亡減少, Treg細(xì)胞亞群減少,凋亡增多,存在Th17與Treg細(xì)胞之間的失衡。
　　2. MTX聯(lián)合潑尼松治療方案在改善關(guān)節(jié)炎指數(shù),踝關(guān)節(jié)腫脹度,抑制血清IL-17水平,調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡等方面療效顯著,但是比較容易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松,體重減輕。
　　3.甲氨蝶呤聯(lián)合羥氯喹、柳氮磺吡啶治療方案在改善關(guān)節(jié)炎指數(shù),

10、踝關(guān)節(jié)腫脹度等方面的作用相對(duì)較弱,它可以抑制血清IL-17水平、降低Th17細(xì)胞亞群的數(shù)量,同時(shí)增加Treg細(xì)胞亞群的數(shù)量,調(diào)節(jié)Th17/Treg的平衡可能是其發(fā)揮療效的機(jī)制。
　　4.甲氨蝶呤聯(lián)合益賽普治療可以抑制血清IL-17水平,同時(shí)減少Treg細(xì)胞亞群的凋亡,很可能通過調(diào)節(jié)Th17/Treg之間的平衡而發(fā)揮其治療RA的作用。
　　5.各治療組均不通過促進(jìn)Th17細(xì)胞亞群的凋亡來調(diào)節(jié)Th17/Treg的平衡而發(fā)揮治療R