富含干細胞的鼠切牙頸環(huán)上皮細胞的分離和原代培養(yǎng).pdf

1、目的：制作大乳鼠切牙牙胚的組織切片，顯微鏡下觀察新出生的大乳鼠切牙牙胚發(fā)育情況，選擇牙胚發(fā)育處于鐘狀期的乳鼠進行下一步實驗。將鐘狀期大乳鼠切牙牙胚經(jīng)酶消化后，體現(xiàn)顯微鏡下分離頸環(huán)上皮細胞并進行體外培養(yǎng)，觀察頸環(huán)上皮細胞的形態(tài)，純化后免疫組織化學染色法進行鑒定。本實驗旨在建立牙齒上皮干細胞的分離和體外培養(yǎng)模式，以提供牙齒上皮干細胞的種子細胞來源，為牙齒上皮干細胞的移植奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.大乳鼠切牙牙胚組織切片的制作：選

2、擇新出生的大乳鼠，鼠齡分別為l天、2天和3天，斷頸處死后，剪取下頜骨，不行脫鈣，直接按常規(guī)要求制備成石蠟包埋組織塊，梯度酒精脫水，二甲苯透明，行HE染色后光學顯微鏡下觀察。 2.實驗～：分離并培養(yǎng)大乳鼠切牙頸環(huán)上皮細胞： ①取出生2天的大乳鼠，引頸處死，置75％酒精浸泡2-3秒鐘，超凈工作臺內(nèi)無菌條件下用眼科剪刀剪取下頜骨，盡量剔凈下頜骨以外的組織，放入盛有含雙抗的Hnks液培養(yǎng)皿中，洗凈血液，轉(zhuǎn)入另一盛有含雙抗的Han

3、ks液培養(yǎng)皿中，置體視顯微鏡下，小心用探針分離出下切牙牙胚。經(jīng)酶消化后，用顯微鑷從牙胚中機械撕脫出牙囊和牙乳頭，將成釉器用培養(yǎng)液沖洗，置于培養(yǎng)皿中體視顯微鏡下從成釉器中切取頸環(huán)組織。移至培養(yǎng)瓶陡置于100％濕度，5％CO2，37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。 ②不同培養(yǎng)基培養(yǎng)頸環(huán)上皮細胞：將分離的頸環(huán)組織分別置于1640培養(yǎng)基和DMEM/F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察頸環(huán)上皮細胞在兩種不同培養(yǎng)基中的生長情況，探索較有利于頸環(huán)組織生長的基本條件。

4、 3.實驗二：純化培養(yǎng)的上皮細胞，并免疫組織化學方法鑒定： ①頸環(huán)上皮細胞的純化：待上述培養(yǎng)的細胞鋪滿培養(yǎng)皿底，加入消化液振蕩消化，棄上清，加入培養(yǎng)基，分別移至Ⅳ型膠原包被的培養(yǎng)皿和未作處理的培養(yǎng)皿內(nèi)。待細胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，置37℃、5％CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔日換液。經(jīng)3-5次換液，更換鼠lV型膠原包被的培養(yǎng)皿，并重復上述過程。觀察lV型膠原包被的培養(yǎng)皿對細胞純化的效果。 ②對純化的原代細胞常

5、規(guī)制備細胞爬片，一抗為兔抗鼠的β1整合素多克隆抗體和CK角蛋白單克隆抗體，用0.1m1/L的PBS液替代一抗作空白對照。免疫組織化學染色過程按檢測試劑盒說明，分別以所培養(yǎng)細胞能否呈克隆狀生長和β1整合素、角蛋白免疫細胞化學染色進行鑒定。 結(jié)果： 1.大乳鼠切牙牙胚組織切片制作： ①出生1天大乳鼠切牙牙胚組織切片：可見幼稚的頸環(huán)結(jié)構(gòu)，組織切片可見內(nèi)釉上皮、外釉上皮和中間層細胞。頸環(huán)組織細胞的活力及增殖能力及代謝活動

6、較幼稚。 ②出生2天大乳鼠切牙牙胚組織切片：可見清楚的頸環(huán)結(jié)構(gòu)，組織切片可見內(nèi)釉上皮、外釉上皮和中間層細胞。頸環(huán)組織細胞的活力及增殖能力均較強，代謝活動也十分旺盛。 ③出生3天大乳鼠切牙牙胚組織切片：可見清楚的頸環(huán)結(jié)構(gòu)，組織切片可見內(nèi)釉上皮、外釉上皮和中間層細胞。但出生3天大鼠的頸環(huán)上皮細胞較第2天的扁平。 本試驗選取出生2天大乳鼠切牙的牙胚作細胞培養(yǎng)。 2.大乳鼠切牙頸環(huán)組織的分離和上皮細胞的培養(yǎng)：

7、 ①大乳鼠切牙頸環(huán)組織的分離：從出生2天大乳鼠頭部剪取下頜骨時，由于新生大乳鼠頭部鈣化未完全，較易剪取獲得完整的下頜骨。置于體視顯微鏡下可以清楚地見到切牙牙胚，能夠獲得完整的下切牙牙胚。經(jīng)消化處理后可以順利地獲得頸環(huán)組織。 ②大乳鼠切牙頸環(huán)上皮細胞的培養(yǎng)： DMEMI/F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)：將獲得的頸環(huán)組織培養(yǎng)24小時后，可觀察到少量細胞游出組織塊。原代培養(yǎng)細胞為混雜細胞，包括形態(tài)、排列明顯不同的兩種細抱：一種為纖維

8、樣的細胞，呈長梭形，細胞問較分散；另一種為上皮細胞，呈多角形，細胞連接緊密，呈克隆狀生長。上皮細胞被成纖維樣細胞包圍，呈“島”樣分布。 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)：頸環(huán)細胞在1640培養(yǎng)基中生長的情況和DEM/F-12培養(yǎng)基基本相同。但在細胞生長后期細胞的活力不及DMEM/-12培養(yǎng)基好，這可能與培養(yǎng)基的組成有關(guān)。 DMEM/F-12培養(yǎng)基較有利于頸環(huán)絀胞的生長。 3.細胞的純化及免疫組織化學鑒定： ①純化切牙頸

9、環(huán)上皮細胞： Ⅳ型膠原純化：經(jīng)2-3次更換lV型膠原包被的培養(yǎng)皿，纖維樣細胞被完全除去，貼壁細胞全部是上皮細胞，體積較小較圓，胞漿豐富，胞核大，含2～3個核仁，長滿后細胞密集排列為多角形，能夠形成較大的克隆。 未包被純化：經(jīng)2-3次更換培養(yǎng)皿，纖紿羊細胞未被完全除去，貼壁細胞部分是上皮細胞，體積較小較圓，胞漿豐富，胞核大，周圍有少量的纖維細胞。 ②培養(yǎng)細胞的免疫組織化學鑒定：頸環(huán)上皮細胞抗角蛋白和β1多克隆抗體染

10、色…性，細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)紅色著色的陽性表達，空白對照組染色陰性。 結(jié)論： 1.出生2天的大乳鼠切牙牙腿組織切片，可見清楚的頸壞結(jié)構(gòu)，并可見內(nèi)釉上皮、外釉上皮和中間細胞。頸環(huán)組織細胞的活力及增殖能力均較強，代謝活動也十分旺盛，且出生2天人乳鼠切牙牙胚，未完全鈣化，較容易獲得，綜合分折，選擇出生2天大乳鼠切牙牙胚作為本實驗的觀察對象。 2.糾胞在兩種不同培養(yǎng)基中的生長情況分析表明，在DMEM F-12培養(yǎng)基中生長的細胞

11、活力及生長狀態(tài)較在1640培養(yǎng)基為好，這可能與DMEM F-12培養(yǎng)基內(nèi)含有利于細胞生長的營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。 3.頸環(huán)上皮細胞在Ⅳ型膠原底物上貼壁數(shù)量多且生長良好，明顯優(yōu)于未包被的培養(yǎng)組，說明Ⅳ型膠原可以增加頸環(huán)上皮細胞的粘附。未作處理組細胞的增殖速度明顯減緩，其原可能是缺乏外在的細胞外基質(zhì)，貼壁細胞少，可能與細胞密度依賴性抑制有關(guān)。 4.純化細胞的免疫組織化學鑒定結(jié)果表明，頸環(huán)上皮細胞抗角蛋白CK和β1多克隆抗體染色陽性，