奶牛乳腺炎中成纖維細(xì)胞分泌的SDF-1對乳腺上皮細(xì)胞的作用及機(jī)制研究.pdf

1、奶牛乳腺炎是由于奶牛機(jī)體代謝和生理狀態(tài)改變、乳房損傷及接觸傳染性或環(huán)境性病原微生物等引起的乳腺炎癥反應(yīng)。大量的文獻(xiàn)已經(jīng)證實(shí)乳腺組織中的乳腺上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等組成了乳腺組織的細(xì)胞免疫系統(tǒng)，共同參與乳牛乳腺炎的免疫應(yīng)答。成纖維細(xì)胞是乳腺組織中數(shù)量最多的基質(zhì)細(xì)胞，但其在奶牛乳腺炎和乳腺炎遷延不愈導(dǎo)致乳腺纖維化中的作用及機(jī)制尚不明確。本研究通過對比從奶牛炎性乳腺組織中分離的成纖維細(xì)胞（inflammatoryfibrob

2、lasts，INFs）和從正常乳腺組織分離的成纖維細(xì)胞(normalfibroblasts，NFs)的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）蛋白和炎癥相關(guān)因子的表達(dá)或分泌水平等基本生物學(xué)特性的差異，明確基質(zhì)成纖維細(xì)胞是否參與在奶牛乳腺炎疾病過程中;并進(jìn)一步研究了在INFs中表達(dá)明顯上調(diào)的基質(zhì)衍生因子1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)對奶牛乳腺上皮細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及機(jī)制

3、，進(jìn)而探究成纖維細(xì)胞在乳腺炎以及乳腺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的作用，這一研究對奶牛乳腺炎及纖維化的防治具有重要的意義。
　　本研究首先運(yùn)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRCR)和蛋白印跡技術(shù)(Western blot)檢測ECM蛋白Ⅰ型膠原蛋白(Collagen-1)、波形蛋白(Vimentin)及基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)基因水平和蛋白水平的表達(dá);通過qRCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)分別檢測了細(xì)胞因子和趨化因子IL-8、CX

4、CL2和SDF-1的基因和蛋白水平的表達(dá);通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測兩種成纖維細(xì)胞的遷移能力;利用代表大腸桿菌毒力成分的脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）和代表金黃色葡萄球菌毒力成分的脂磷壁酸(lipoteichoicacid，LTA)建立體外的誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞模型檢測ECM相關(guān)蛋白，細(xì)胞因子和趨化因子的蛋白水平表達(dá)。通過以上從不同角度對INFs和NFs生物學(xué)特性的對比，明確成纖維細(xì)胞是否參與奶牛乳腺的炎癥過程。然后，通

5、過建立成纖維細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞的體外間接共培養(yǎng)模式，研究INFs對乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)變化及EMT(epithelial-mesenchymaltransition)標(biāo)志分子如α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和角蛋白(Cytokeratin)表達(dá)的影響;并進(jìn)一步通過一系列分子生物學(xué)的方法研究了在INFs中高表達(dá)的SDF-1對乳腺上皮細(xì)胞的影響及分子機(jī)制。最后，通過建立SDF-1誘導(dǎo)的體外乳腺炎小鼠模

6、型驗(yàn)證SDF-1的促炎性和促纖維化作用。
　　結(jié)果顯示，Collagen-1、Vimentin、MMP-1等ECM蛋白和IL-8、CXCL2和SDF-1等炎性相關(guān)因子在INFs、LPS以及LTA誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)或分泌水平均明顯高于NFs，表明成纖維細(xì)胞參與在奶牛乳腺的炎癥應(yīng)答過程。體外共培養(yǎng)結(jié)果顯示，INFs可誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)從鋪路石樣轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮?，并促進(jìn)EMT標(biāo)志分子α-SMA和Cytokeratin的表達(dá)，表明在共

7、培養(yǎng)條件下，INFs可誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。
　　進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，LPS和LTA處理后的NFs，以及炎性乳腺組織中SDF-1的表達(dá)或分泌都高于正常對照組。外源性SDF-1通過激活NF-κB通路促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)并抑制細(xì)胞增殖。此外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SDF-1在小鼠乳腺中能夠誘發(fā)乳腺炎和輕微的纖維化，而SDF-1的特異性抑制劑可以減輕這一現(xiàn)象，結(jié)果表明INFs分泌SDF1介導(dǎo)其對乳腺上皮細(xì)EMT和炎性誘導(dǎo)過