奶牛乳腺上皮細(xì)胞和奶牛臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)的試驗(yàn)研究.pdf

1、為了研究UC-MSCs與BMECs共培養(yǎng)的最適濃度比和最佳作用時(shí)間及其作用機(jī)制。本試驗(yàn)將P3代UC-MSCs與P3代BMECs按照濃度比例為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶10、1∶50、1∶100、1∶1000、2∶1等不同比例隨機(jī)混合培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)立UC-MSCs與BMECs單純培養(yǎng)組為對(duì)照組，并分別于0h，24h，48h，72h，96h，120h和144h時(shí)觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，測(cè)定細(xì)胞貼壁率，

2、并檢測(cè)EGF、bFGF、TGF-β、HGF、TNF-α、TNF-β和LD的表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)CcOⅠ、HK、LDH和PK的活性，來(lái)探究UC-MSCs與BMECs共培養(yǎng)的作用機(jī)制，從而為UC-MSCs在畜牧生產(chǎn)上的研究應(yīng)用提供新的思路和理論依據(jù)。
　　結(jié)果顯示:體外分離培養(yǎng)的UC-MSCs細(xì)胞形態(tài)均一、具有成纖維樣細(xì)胞外觀，排列緊密，有一定方向性;通過(guò)堿性磷酸酶染色后可見細(xì)胞呈深棕紅色;能夠被誘導(dǎo)為成脂、成骨細(xì)胞;將UC-MSCs和

3、BMECs按照不同濃度比混合共培養(yǎng)后，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無(wú)抑制作用;MTT檢測(cè)增殖發(fā)現(xiàn)1∶2濃度組OD值最高，細(xì)胞增殖最快，明顯高于單純UC-MSCs組和單純BMECs組，各組OD值在72h時(shí)均達(dá)到最高，隨后下降;共培養(yǎng)后細(xì)胞貼壁率與時(shí)間成正比，其中1∶2濃度組細(xì)胞貼壁率最高，顯著高于單純BMECs組;UC-MSCs和BMECs按不同濃度混合共培養(yǎng)后，1∶2濃度組培養(yǎng)液上清中的EGF水平顯著高于1∶1000組、單純UC-MSCs組及單純

4、BMECs(P＜0.05)，且在72h、96h、120h顯著高于0h(P＜0.05);1∶2組的TGF-α分泌水平最低，1∶1組、1∶2組和2∶1組顯著低于單純BMECs組(P＜0.05)，1∶1組、1∶2組、1∶3組、2∶1組TGF-β水平顯著高于1∶1000組及單純BMECs組(P＜0.05)，且72h時(shí)TGF-α和TGF-β分泌水平顯著低于0h和144h(P＜0.05);1∶1組、1∶2組及2∶1組bFGF分泌水平顯著高于1∶50

5、、1∶100、1∶1000和單純BMECs組（P＜0.05），且48h、72h的分泌量顯著高于0h、24h、144h(P＜0.05);HGF分泌水平在各組之間差異均不顯著，但1∶2組的分泌量最大，各組HGF分泌量在72h時(shí)最高，顯著高于0h、24h、48h(P＜0.05);1∶1、1∶2、1∶3、1∶4濃度組HK的活性顯著高于1∶1000、BMECs單純培養(yǎng)組(P＜0.05)，且在72h、96h、120h時(shí)活性顯著高于0h、24h、48

6、h、144h(P＜0.05); LD的表達(dá)量在1∶2濃度組達(dá)到最高，1∶1、1∶2、2∶1濃度組顯著高于BMECs單純培養(yǎng)組(P＜0.05)，且在72h時(shí)與0h相比差異顯著(P＜0.05);PK活性在1∶2濃度組達(dá)到最高，且1∶1、1∶2濃度組活性顯著高于1∶1000、BMECs單純培養(yǎng)組(P＜0.05)，且其活性隨著時(shí)間增加逐漸增強(qiáng)，在72h時(shí)達(dá)到最高，顯著高于0h、120h、144h（P＜0.05）;1∶1、1∶2、1∶3濃度組的L

7、DH活性顯著高于1∶1000和BMECs單純培養(yǎng)組(P＜0.05)，且LDH活性隨時(shí)間增加呈逐漸下降趨勢(shì)，0h組與其他各組相比均差異顯著(P＜0.05)，72h組與0h、24h、144h組相比均差異顯著(P＜0.05);1∶2組TNF-α的表達(dá)量最低，顯著低于1∶10、1∶50、1∶1000、UC-MSCs單純培養(yǎng)組和BMECs單純培養(yǎng)組(P＜0.05)，且濃度在0h-72h之間呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，并且在72h時(shí)達(dá)到最低，顯著低于0h、96h

8、、120h和144h時(shí)(P＜0.05);1∶1組、1∶2組、2∶1組的TNF-β表達(dá)量顯著低于1∶10、1∶50、1∶100、1∶1000、UC-MSCs單純培養(yǎng)組和BMECs單純培養(yǎng)組(P＜0.05)，且表達(dá)量在72h達(dá)到最低，隨后開始升高，48h、72h表達(dá)量顯著低于0h、120h和144h時(shí)(P＜0.05);共培養(yǎng)組的CcOⅠ活性變化不大，除1∶100、1∶1000、2∶1組外，其余各個(gè)共培養(yǎng)組的CcOⅠ活性均顯著低于BMECs單

9、純培養(yǎng)組(P＜0.05)，且其活性在72h時(shí)最低，顯著低于除48h組之外的各組(P＜0.05)。
　　本試驗(yàn)研究得出以下結(jié)論:①本試驗(yàn)成功的在體外分離培養(yǎng)出奶牛臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。②本試驗(yàn)成功的建立了UC-MSCs和BMECs共培養(yǎng)體系，通過(guò)試驗(yàn)摸索發(fā)現(xiàn)UC-MSCs和BMECs比例為1∶2的濃度組，培養(yǎng)至第72h時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)最佳。③UC-MSCs和BMECs共培養(yǎng)能夠促進(jìn)共培養(yǎng)體系細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞貼壁率。④UC-MSCs和BMEC