NPY受體亞型對心肌肥厚大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能影響的研究.pdf

1、背景：
　　心肌肥厚是心臟對血液動(dòng)力超負(fù)荷及神經(jīng)體液刺激的代償性反應(yīng)，是心臟功能從代償期向失代償期演變及心臟結(jié)構(gòu)不可逆發(fā)展的關(guān)鍵階段，心肌肥厚即使在早期也是一種有害的反應(yīng)，可增加心血管疾病的發(fā)病率及死亡率，是心肌缺血、嚴(yán)重心律失常和心源性猝死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。持續(xù)的心肌肥厚使心肌細(xì)胞某些蛋白、基因的表達(dá)發(fā)生改變，心肌細(xì)胞凋亡增加，引起心肌細(xì)胞的喪失和功能的惡化最終發(fā)展至失代償性心力衰竭。神經(jīng)肽Y(Neuropeptide Y，NPY

2、)是36個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白多肽，與胰多肽（PP）、肽 YY(PYY)同屬一個(gè)家族。大量研究證實(shí)NPY廣泛分布于哺乳動(dòng)物的中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，并與該部位神經(jīng)元中的其他神經(jīng)遞質(zhì)共同釋放，廣泛參與循環(huán)系統(tǒng)的功能調(diào)節(jié)，這種調(diào)節(jié)作用主要有：直接的收縮和舒張血管；潛在的促內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞有絲分裂；心肌收縮的變力性及變時(shí)性；作為心肌肥厚的前刺激原。NPY可顯著促進(jìn)早期肥大反應(yīng)基因 c-jun mRNA、中期肥大反應(yīng)基因、胚心基因(MHC

3、)和心鈉素(ANF)表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)表明NPY在pM級濃度就可刺激蛋白合成，增加細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量，在nM級濃度可抑制蛋白降解。體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)NPY是誘導(dǎo)心肌肥厚的一個(gè)重要介質(zhì)，同其它肥大因子共同作用引起心肌肥厚，NPY在高血壓的發(fā)展和維持過程中起重要作用，參與高血壓及心肌梗死相關(guān)的心肌重構(gòu)，使心功能惡化或失代償而出現(xiàn)明顯的心力衰竭癥狀。
　　NPY存在六種G蛋白耦聯(lián)受體，其中五種已在哺乳動(dòng)物中得到克?。╕1，Y2，Y4，Y5，y

4、6），最近有學(xué)者推斷Y3受體可能是由Y1，Y2，Y5受體組成的異源三聚體。由于在大多數(shù)哺乳動(dòng)物體內(nèi)y6受體蛋白是被截短的，所以認(rèn)為y6受體僅存在于低等動(dòng)物體內(nèi)，同Y3受體一樣其藥理學(xué)特性仍然存在爭議。六種NPY受體中，Y1，Y2，Y5受體是心臟中主要存在的受體亞型，參與了NPY對心臟功能的各種調(diào)節(jié)過程。
　　我們前期體外研究已經(jīng)證實(shí)NPY受體亞型Y1、Y2、Y5在成年大鼠心肌組織中均有表達(dá)；NPY通過Y1受體、Y5受體誘導(dǎo)心肌肥厚

5、，Y2受體對肥厚起到負(fù)調(diào)控作用；在壓力超負(fù)荷心肌肥厚中，四種受體表達(dá)均降低，Y2受體降低幅度最大，而Y1受體降低最少，由此導(dǎo)致的綜合效應(yīng)是，NPY誘導(dǎo)心肌向肥厚方向發(fā)展。本研究將根據(jù)我們體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，針對Y1、Y2、Y5受體進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步闡明NPY受體亞型在心臟結(jié)構(gòu)和功能調(diào)節(jié)中的作用，為以后應(yīng)用相應(yīng)的受體激動(dòng)劑或抑制劑預(yù)防及治療心肌肥厚及相關(guān)的心臟并發(fā)癥提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。同時(shí)，通過超聲心動(dòng)圖、血流動(dòng)力學(xué)和病理組織學(xué)等方法評

6、價(jià)腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠心肌肥厚情況，探討大鼠壓力超負(fù)荷性心肌肥厚模型建立的最佳方法。
　　第一部分：心肌肥厚動(dòng)物模型的建立
　　研究目的：
　　改良傳統(tǒng)壓力超負(fù)荷性動(dòng)物模型建立方法，探討構(gòu)建心肌肥厚大鼠模型的最佳方式，應(yīng)用超聲心動(dòng)圖無創(chuàng)動(dòng)態(tài)檢測心肌肥厚大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化，為進(jìn)一步進(jìn)行心肌肥厚的干預(yù)提供基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　　1.縮窄大鼠腹腔動(dòng)脈與前腸系膜動(dòng)脈分支之間的腹主動(dòng)脈，建立大鼠壓

7、力超負(fù)荷性心肌肥厚模型。
　　2.應(yīng)用超聲心動(dòng)圖、血流動(dòng)力學(xué)及病理組織學(xué)（心臟重量指數(shù)、HE染色及Masson三色染色）方法觀察AAC術(shù)后3、4、6周大鼠心肌肥厚及心功能的變化。
　　3.采用Elisa方法檢測大鼠BNP血漿濃度。
　　結(jié)果：
　　1.超聲心動(dòng)圖檢測發(fā)現(xiàn)：與Sham組相比，大鼠AAC術(shù)后3、4、6周的IVS、LVPW明顯增加，4周時(shí)增加最明顯（P<0.01，3周時(shí)IVSs P<0.05）；無明顯的

8、室腔擴(kuò)大表現(xiàn)；FS、EF及CO值明顯下降，4周時(shí)下降最明顯，6周時(shí)稍有恢復(fù)(P<0.01，F(xiàn)S、EF值3周時(shí)P<0.05，6周時(shí)FS、EF、CO P>0.05)，但均在正常范圍；PFVA、E峰值明顯下降，PFVA在4周時(shí)下降最明顯（P<0.01，3周時(shí)PFVA P>0.05），由于大鼠心率較快，以至于不能測量E/A比值；根據(jù)超聲測量數(shù)據(jù)通過公式計(jì)算的左室重量與實(shí)際稱重值有非常強(qiáng)的相關(guān)性（r=0.997）。
　　2.血流動(dòng)力學(xué)檢測A

9、AC術(shù)后3、4、6周的SBP、DBP、平均動(dòng)脈壓、脈壓、左室內(nèi)壓、Max dP/dt、Min-dP/dt均較Sham組顯著升高（P<0.01），以上各指標(biāo)4周時(shí)升高最明顯（P<0.01）。Tau值各組間無明顯差異（P>0.05）。
　　3. AAC術(shù)后3、4、6周LVMI、HMI、CSA、PVFR均明顯增加（P<0.01，PVFR6周時(shí)P<0.05），4周時(shí)增加最顯著，IFR各組間無顯著性差異（P>0.05）。
　　4.各時(shí)

10、間點(diǎn)AAC組血漿BNP水平均明顯高于Sham組（P<0.01）,隨術(shù)后時(shí)間的延長，AAC組大鼠血漿BNP水平逐漸升高。
　　小結(jié)：
　　1.縮窄大鼠腹腔動(dòng)脈與前腸系膜動(dòng)脈分支之間的腹主動(dòng)脈，術(shù)后4周可出現(xiàn)明顯的心肌肥厚，是一種較為理想的心肌肥厚動(dòng)物模型建立方法，為后續(xù)的干預(yù)研究提供了基礎(chǔ)。
　　2.無創(chuàng)超聲心動(dòng)圖可準(zhǔn)確評價(jià)大鼠心臟結(jié)構(gòu)和收縮功能的變化，對舒張功能的評價(jià)尚需進(jìn)一步的探索。
　　3.心肌肥厚大鼠血漿B

11、NP濃度明顯升高，且隨術(shù)后時(shí)間的延長逐漸升高。
　　第二部分：NPY受體亞型對心肌肥厚大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響
　　研究目的：
　　應(yīng)用高特異性和親和力的受體抑制劑——BMS193885(Y1)、BIIE0246(Y2)、L152804(Y5)以及Y2受體激動(dòng)劑——C2-NPY，通過腹腔注射至大鼠體內(nèi)，在體觀察各受體對心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響，為心肌肥厚及相關(guān)的心臟并發(fā)癥藥物干預(yù)提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　研究方法

12、：
　　1.按第一部分方法建立AAC心肌肥厚大鼠模型。
　　2.術(shù)后第3天各組大鼠開始分別注射Y1、Y2、Y5受體抑制劑、Y2受體激動(dòng)劑及對照溶劑，每天腹腔注射1次，連續(xù)注射7周。
　　3.超聲心動(dòng)圖檢測：分別于術(shù)前、術(shù)后3天、3、5、7周行超聲心動(dòng)圖檢測，動(dòng)態(tài)觀察大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化。
　　4.血流動(dòng)力學(xué)檢測：術(shù)后7周心臟超聲檢測后24小時(shí)內(nèi)行血流動(dòng)力學(xué)檢測。
　　5.心臟稱重，取部分心肌組織行HE及

13、Masson染色。
　　6. Elisa法檢測大鼠NPY、BNP血漿濃度；放免法測定大鼠血漿AngⅡ、Ald含量；生化法檢測血漿CRP及肝腎功能。
　　7. Western blot方法檢測心肌組織Y1、Y2、Y5受體及TGF-β1蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1. Y1受體抑制劑（BMS193885）
　　與Sham組相比，BMS193885組、10％乙醇對照組的LVMI、HMI、CSA、PVFR、IFR、

14、SBP、DBP、血漿BNP、NPY、AngⅡ、Ald濃度、TGF-β1蛋白表達(dá)均顯著性增加（P<0.01，10%乙醇對照組的Ald血漿濃度 P<0.05）；IVSd、LVPWd3、5、7周時(shí)均顯著性增加（P<0.01）；Y1、Y2、Y5受體蛋白表達(dá)均顯著性降低（P<0.01）。與10%乙醇對照組相比，BMS193885組的HR7周時(shí)顯著性增加（P<0.01），EF值3周時(shí)顯著性降低（P<0.05）； Max dP/dt、Min-dP/d

15、t及血漿NPY濃度均顯著性降低（P<0.01）；而兩組間LVMI、HMI、IVSd、LVPWd、CSA、PVFR、IFR、SBP、DBP、左室內(nèi)壓，血漿 BNP、AngⅡ、Ald濃度及Y1、Y2、Y5、TGF-β1蛋白表達(dá)無顯著性差異。
　　2. Y2受體抑制劑（BIIE0246）和激動(dòng)劑（C2-NPY）
　　與Sham組比較，BIIE0246組、C2-NPY組、10%乙醇對照組、NS對照組的LVMI、HMI、CSA、PVF

16、R、IFR、SBP及DBP均顯著性增加（P<0.01，BIIE0246組的LVMI、NS對照組的IFR、SBP、DBP P<0.05，BIIE0246組的HMI、IFR、SBP、DBP P>0.05）；BIIE0246組、10%乙醇對照組的IVSd、LVPWd3、5、7周時(shí)均顯著性增加（P<0.01，BIIE0246組的IVSd3、5、7周時(shí)、LVPWd5周時(shí)P<0.05）；C2-NPY組、NS對照組的IVSd、LVPWd5、7周時(shí)均顯

17、著性增加（P<0.01，NS組5周時(shí) P<0.05）；除BIIE0246組血漿NPY濃度顯著性降低外（P<0.01），BIIE0246組、C2-NPY組、10%乙醇對照組、NS對照組的BNP、NPY、AngⅡ、Ald血漿濃度、TGF-β1蛋白表達(dá)均顯著性升高（P<0.01，BIIE0246組、10%乙醇對照組的Ald血漿濃度、NS對照組的TGF-β1蛋白表達(dá) P<0.05）；BIIE0246組、C2-NPY組、10%乙醇對照組、NS對照

18、組的Y1、Y2、Y5受體蛋白表達(dá)均顯著性降低（P<0.01）。
　　與10%乙醇對照組比較，BIIE0246組的LVMI、HMI、IVSd、LVPWd、CSA、PVFR以及IFR均顯著性降低（P<0.01，HMI、LVPWd、IFR P<0.05）；HR3、7周時(shí)心率顯著性降低（P<0.05），EF值3、5周時(shí)顯著性降低（P<0.01）；SBP、DBP、左室內(nèi)壓、Max dP/dt、Min-dP/dt及血漿NPY濃度均顯著性降低（

19、P<0.01）；但BNP、AngⅡ、Ald血漿濃度及Y1、Y2、Y5受體、TGF-β1蛋白表達(dá)兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與NS對照組相比，C2-NPY組的LVMI、HMI、IVSd、LVPWd、CSA、PVFR以及IFR均顯著性增加（P<0.01，IVSd、LVPWd P<0.05）；HR在3、5、7周時(shí)顯著性增加（P<0.01,5周時(shí) P<0.05），EF值在3周時(shí)顯著性升高（P<0.05）；SBP、DBP、血漿BNP、NPY濃度、TGF-

20、β1、Y2、Y5受體蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01，SBP、DBP、Y2、Y5受體蛋白表達(dá)P<0.05）；兩組間Max dP/dt、Min-dP/dt、血漿AngⅡ、Ald濃度，Y1受體蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3. Y5受體抑制劑（L152804）
　　與10%乙醇對照組相比，L152804組的HR7周時(shí)明顯升高（P<0.01），EF值3周時(shí)顯著性降低（P<0.01），在第5周后恢復(fù)；SBP、DBP、左室內(nèi)壓、Max d

21、P/dt、Min-dP/dt及血漿 NPY濃度均顯著性降低（P<0.01，SBP、Min-dP/dt P<0.05），而 LVMI、HMI、IVSd、LVPWd、CSA、PVFR、IFR、血漿 BNP、AngⅡ、Ald濃度及Y1、Y2、Y5受體、TGF-β1蛋白表達(dá)兩組間無明顯差異。
　　4.藥物副作用
　　與Sham組相比，BMS193885組、BIIE0246組、C2-NPY組、L152804組、10%乙醇對照組、NS對

22、照組的血生化除C2-NPY組的Cr及CRP顯著性降低外（P<0.05）其他指標(biāo)均無明顯變化。
　　小結(jié)：
　　1. NPY通過Y1受體使心肌肥厚大鼠心率減慢，心肌收縮力增強(qiáng)，對血壓及心肌肥厚無明顯影響。
　　2. NPY通過Y2受體使心肌肥厚大鼠心率增快，心肌收縮力增強(qiáng)，血壓升高并進(jìn)一步加劇心肌肥厚。
　　3. NPY通過Y5受體使心肌肥厚大鼠心率減慢，心肌收縮力增強(qiáng)，血壓升高，對心肌肥厚無明顯影響。
　　

23、全文結(jié)論：
　　縮窄大鼠腹腔動(dòng)脈與前腸系膜動(dòng)脈分支之間的腹主動(dòng)脈，術(shù)后 4 周可出現(xiàn)明顯的心肌肥厚，是一種較為理想的心肌肥厚動(dòng)物模型建立方法。在壓力超負(fù)荷導(dǎo)致的心肌肥大中，NPY通過Y1受體減慢心率，增強(qiáng)心肌收縮力；通過Y2受體使心率增快，心肌收縮力增強(qiáng)，血壓升高并進(jìn)一步加劇心肌肥厚；通過Y5受體使心率減慢，心肌收縮力增強(qiáng)，血壓升高。由上述結(jié)果可知，在壓力超負(fù)荷時(shí)，NPY 血漿濃度升高可增強(qiáng)心肌收縮力，調(diào)節(jié)心率的變化，在代償期為維