MUC4、MUC16在卵巢癌細(xì)胞系癌變機(jī)制及與卵巢癌臨床病理特征關(guān)系研究.pdf

1、本文從以下兩部分進(jìn)行探討：
　　一.MUC4、MUC16在卵巢癌細(xì)胞系癌變機(jī)制研究
　　目的:
　　本研究對(duì)卵巢痛SKOV3、OVAR3、CAOV3三種細(xì)胞系行細(xì)胞培養(yǎng)蛋白濃度測(cè)定，用半定量PCR、熒光定量PCR分析細(xì)胞MUC4、MUC16mRNA水平，采用Western Blot、免疫細(xì)胞化學(xué)SABC法檢測(cè)MUC4、MUC16蛋白表達(dá)水平，目的探索MUC4、MUC16基因在卵巢癌細(xì)胞系致癌機(jī)制、在RNA水平和蛋白水平

2、表達(dá)，并揭示臨床早期或晚期卵巢癌患者CA125水平正?；虿簧仙龣C(jī)制。
　　方法：
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞、OVCAR-3細(xì)胞培養(yǎng)于高糖DMEM+10％胎牛血清+1ml青/鏈霉素的培養(yǎng)基中，人卵巢痛CAOV-3細(xì)胞培養(yǎng)于McCoy'5A+10％胎牛血清+1ml青/鏈霉素的培養(yǎng)基中，三種細(xì)胞均置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2、總RNA的提取和RT-PCR檢測(cè)
　　應(yīng)用RT-P

3、CR技術(shù)，檢測(cè)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞、OVCAR-3細(xì)胞、CAOV-3細(xì)胞中MUC4及MUC16 mRNA水平的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參。提取細(xì)胞總RNA，以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，用MUC4及MUC16相應(yīng)引物特異性擴(kuò)增相應(yīng)基因。半定量RT-PCR產(chǎn)物，包括237bp(MUC4)和114bp(MUC16)，用2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行半定量檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)結(jié)束后分析擴(kuò)增

4、曲線和融解曲線，用Comparative Delta-delta Ct進(jìn)行相對(duì)定量分析。
　　3、細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)
　　采用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞、OVCAR-3細(xì)胞、CAOV-3細(xì)胞中MUC4及MUC16蛋白表達(dá)情況。將細(xì)胞均勻種植于鋪有細(xì)胞爬片的24孔板中，培養(yǎng)箱中孵育24h，棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)液，PBS洗3遍，取出細(xì)胞爬片，4％多聚甲醛固定30min，3％H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，封閉液37℃孵育1h，

5、一抗4℃孵育過夜，然后用二抗37℃避光孵育1h，PI染核后封片，在熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。
　　4、免疫細(xì)胞化學(xué)SABC法
　　細(xì)胞免疫化學(xué)SABC法與細(xì)胞免疫熒光法相似，可用于檢測(cè)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞、OVCAR-3細(xì)胞、CAOV-3細(xì)胞中MUC4及MUC16蛋白表達(dá)情況。
　　5、Westen Blot實(shí)驗(yàn)
　　應(yīng)用Westen Blot方法檢測(cè)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞、OVCAR-3細(xì)胞、CAOV-3

6、細(xì)胞中MUC4及MUC16蛋白表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參。提取三種細(xì)胞樣本的蛋白，制備蛋白樣本，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、顯色。
　　結(jié)果：
　　1、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:MUC4在人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞、OVCAR-3細(xì)胞、CAOV-3細(xì)胞中表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);MUC16 mRNA在人卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞中表達(dá)量最高，CAOV-3細(xì)胞次之，SKOV-3細(xì)胞表達(dá)

7、量最低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、細(xì)胞免疫熒光法、免疫細(xì)胞化學(xué)法及Westen Blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn):MUC4蛋白在人卵巢癌 SKOV-3細(xì)胞和OVCAR3細(xì)胞中不表達(dá)，在CAOV-3細(xì)胞中有表達(dá);MUC16蛋白在人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞、OVCAR-3細(xì)胞、CAOV-3細(xì)胞中均有表達(dá)，并且在OVCAR-3細(xì)胞中表達(dá)最高，在CAOV-3細(xì)胞次之，在SKOV-3細(xì)胞中表達(dá)最低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。<

8、br>　　結(jié)論：
　　1、人卵巢癌SKOV-3、OVCAR-3和CAOV-3三種細(xì)胞系中MUC4及MUC16在mRNA水平及蛋白水平表達(dá)情況各不相同，早期卵巢痛50％病人CA125(MUC16)水平正常、或晚期病人CA125(MUC16)水平不上升與CA125(MUC16)在不同類型卵巢癌不表達(dá)或低表達(dá)有關(guān)。
　　2、MUC4及MUC16與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系，MUC4可能單獨(dú)或聯(lián)合MUC16作為卵巢痛臨床診斷的輔助

9、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。
　　二.MUC4、MUC16和NF-κB/p65在正常卵巢組織和卵巢腫瘤的表達(dá)及與卵巢癌臨床病理關(guān)系研究
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)MUC4、MUC16和NF-κ B/p65在正常卵巢組織和卵巢上皮性腫瘤中的表達(dá)，分析這些基因的表達(dá)與卵巢癌臨床病理相關(guān)性，為卵巢癌的早期診斷、預(yù)后判斷尋找標(biāo)志物及提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法，檢測(cè)MUC4、MUC1

10、6和NF-κ B/p65在10例正常卵巢組織、20例卵巢良性上皮性腫瘤，10例卵巢交界性上皮性腫瘤，40例卵巢惡性上皮性腫瘤中的表達(dá)及與臨床病理關(guān)系;研究對(duì)象入院后在空腹情況下抽取肘靜脈血2ml，分離血清用于CA125檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　(1)MUC4、MUC16、NF-κB/p65在正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤和卵巢癌陽(yáng)性表達(dá)程度不同:MUC4在正常卵巢組織、良性腫瘤、交界性腫瘤和卵巢癌陽(yáng)性表達(dá)率分別為0、10％(2/2

11、0)、40％(4/10)、90％(36/40); MUC16分別為為10％(1/10)、20％(4/20)、60％(6/10)和87.5％(27/52);NF-κB/p65分別為10％(1/10)、20％(4/20)、60.0％(6/10)和85.0％(34/40)。
　　(2)MUC4、MUC16、NF-κB/p65在卵巢癌不同亞型表達(dá)情況:MUC4在漿液性卵巢癌、粘液性卵巢痛和其他類型卵巢上皮癌陽(yáng)性表達(dá)率分別為86.36％(1

12、9/22)、75％(8/12)和50％(3/6)，漿液性和粘液性兩組差異不顯著(p＞0.05)。MUC16陽(yáng)性表達(dá)率分別為81.81％(18/22)、25％(3/12)和50％(3/6)，漿液性和粘液性兩組異顯著(p＜0.05)。NF-κB/p65陽(yáng)性表達(dá)率分別為86.36％(19/22)、33.33％(4/12)和33.33％(2/6)，漿液性和粘液性兩組差異顯著(p＜0.05)。在漿液性卵巢癌MUC4、MUC16和NF-κB/p65

13、都出現(xiàn)較高的陽(yáng)性表達(dá)率，在粘液性卵巢癌MUC4的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于MUC16和NF-κB/p65，差異有顯著性(p＜0.05)。
　　(3)MUC4、MUC16、NF-κ B/p65卵巢癌表達(dá)情況與臨床期別關(guān)系:MUC4在Ⅰ-Ⅱ期和Ⅲ-Ⅳ期卵巢癌陽(yáng)性表達(dá)率分別為91.67％(11/12)和75％(21/28)，兩組相比差異顯著(p＜0.05)。MUC16分別為50％(6/12)和85.7％(24/28)，兩組相比較差異顯著(p＜0

14、.05)。NF-κB/p65分別為58.33％(7/12)，82.14％(23/28)，兩組相比差異顯著(p＜0.05)。MUC4在早期卵巢癌表達(dá)明顯高于MUC16和NF-κB/p65，而在晚期卵巢癌三個(gè)標(biāo)志物表達(dá)無(wú)明顯差異。
　　(4)MUC4、MUC16、NF-κB/p65卵巢癌表達(dá)情況與預(yù)后意義關(guān)系:MUC4在有卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性表達(dá)率分別為66.67％(8/12)和57.14％(16/28)，兩者無(wú)顯著

15、差異(p＞0.05)。MUC16分別為83.33％(10/12)和71.42％(20/28)，兩組差異顯著(p＜0.05)。NF-κB/p65分別為為66.67％(8/12)和57.14％(16/24)，兩組無(wú)顯著差異(p＞0.05)。MUC4在高分化和中低分化卵巢癌組陽(yáng)性表達(dá)率分別為77.77％(7/9)和58.06％(18/31)，兩者差異顯著(p＜0.05)。MUC16分別為33.33％(3/9)和83.87％(26/31)，兩者

16、差異顯著(p＜0.05).NF-κB/p65分別為55.55％(5/9)和77.42％(24/31)，兩組差異顯著(p＜0.05)。在血清CA125值升高組卵巢癌和血清CA125值正常組MUC4陽(yáng)性表達(dá)率分別為76.19％(16/21)和84.21％(16/19)，兩組相比差異不顯著(p＞0.05)。MUC16陽(yáng)性表達(dá)率分別為85.71％(18/21)和42.10％(8/19)，兩組相比差異顯著(p＜0.05)。NF-κB/p65陽(yáng)性表

17、達(dá)率分別為85.71％(18/21)和78.94％(15/19)，相比差異不顯著(p＞0.05)。
　　(5)MUC4和MUC16在卵巢癌中的表達(dá)率和表達(dá)程度相互比較，結(jié)果MUC4的表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度高于MUC16，差異顯著(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1) MUC4、MUC16和NF-κB/p65在卵巢癌出現(xiàn)過度表達(dá)。MUC4、MUC16和NF-κB/p65與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān);MUC4在早期卵巢癌表達(dá)明顯，

18、MUC16過度表達(dá)伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能與預(yù)后不良有關(guān);MUC4單獨(dú)或聯(lián)合MUC16檢測(cè)可能是有效的標(biāo)志物用于卵巢癌的早期診斷和晚期預(yù)后判斷。
　　(2)在粘液性卵巢癌MUC4的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于MUC16和NF-κB/p65，MUC4可用于臨床粘液性卵巢癌診斷和鑒別診斷;
　　(3)MUC4、MUC16和NF-κB/p65表達(dá)相關(guān)性研究，結(jié)果提示黏蛋白與NF-κB/p65表達(dá)相關(guān)性較好，黏蛋白的表達(dá)可能受NF-κB/p65的調(diào)