THY1基因在卵巢癌中的表達及其對卵巢癌細胞生長的影響.pdf

1、背景和目的：卵巢上皮性癌死亡率居婦科惡性腫瘤之首，其中卵巢漿液性囊腺癌占卵巢惡性腫瘤的40％～50％，盡管近二十年來手術(shù)治療及化學藥物治療取得了長足的進步，但晚期卵巢癌患者的預后仍無明顯改善，已成為嚴重威脅婦女生命和健康的惡性腫瘤，因此我們有必要對卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展機制進一步研究和完善。近年越來越多研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌的發(fā)生與11q染色體上等位基因缺失有關(guān)，提示這些區(qū)域可能攜帶某種或某些抑癌基因，LOH研究進一步表明11q22-qter區(qū)域

2、突變與卵巢癌發(fā)生有關(guān)。 人THY1也稱白細胞分化抗原CD90，定位于染色體11q22.3，于1980年由Hamann A等首次發(fā)現(xiàn)，是一種分子量為25-28KD的高度糖基化的細胞表面糖蛋白，是免疫球蛋白超家族中最小的成員，具有糖基磷脂酰肌醇錨定的特點，其組織分布存在顯著差異。一些研究表明THY1能觸發(fā)許多細胞功能，與機體免疫反應(yīng)、細胞增殖、分化、細胞因子釋放、血管生成及凋亡等有重要關(guān)聯(lián)。盡管有關(guān)THY1的研究很多，但其確切功能及

3、生理作用尚不清楚，至今為止，有關(guān)THY1的研究主要集中在血液系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，而有關(guān)其在實體瘤中報道甚少。2003年A-beysingheHR等在對人卵巢癌細胞SKOV3轉(zhuǎn)染11號染色體時發(fā)現(xiàn)了THY1基因?qū)β殉舶┑囊种谱饔?，并通過反義序列轉(zhuǎn)染使無瘤細胞株恢復成瘤性，證實THYl是一種卵巢癌抑癌基因，但其作用機制尚不清楚。2005年LungHL等報道THY1是鼻咽癌發(fā)生轉(zhuǎn)移和進展的候選標記物，是鼻咽癌的一個候選抑癌基因，并認為鼻咽癌細胞株

4、中THY1表達缺失的機制可能是THY1啟動子高度甲基化。 本研究的目的：1．檢測人卵巢漿液性囊腺癌組織中THY1基因的蛋白表達情況；2．構(gòu)建THY1基因真核表達載體并轉(zhuǎn)染人卵巢癌細胞株SKOV3；3．觀察THY1重組載體在體內(nèi)、外對SKOV3生長的影響，以探討THY1基因與卵巢上皮性癌之間的相關(guān)性，為探索THY1真核表達載體作為卵巢癌基因治療靶點提供思路。 材料與方法：通過免疫組織化學方法檢測人卵巢漿液性囊腺癌組織中TH

5、Y1基因的蛋白表達，通過目的基因克隆、載體構(gòu)建技術(shù)，將THY1基因重組于真核表達載體pcDNA3.1(+)，構(gòu)建重組載體pcDNA3.1(+)-THY1，觀察其在體內(nèi)、外對卵巢癌細胞生長的影響。 1．通過免疫組化方法檢測人正常卵巢組織(n=25)、卵巢漿液性囊腺瘤組織(n=25)、卵巢漿液性囊腺癌組織(n=53)中THY1基因的蛋白表達變化，并分析其與臨床病理因素間的關(guān)系； 2．通過RT-PCR方法，從人正常卵巢組織中獲

6、得THY1基因，將其插入真核表達載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建成重組載體pcDNA3.1(+)-THY1，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109，篩選出含有正確插入片段的克隆，經(jīng)PCR、酶切及DNA測序鑒定；實驗分三組：SKOV3-THY1組(利用脂質(zhì)體將構(gòu)建成功的重組載體轉(zhuǎn)染人卵巢癌細胞SKOV3)、SKOV3-Null組(空載體轉(zhuǎn)染SKOV3)、SKOV3組(未轉(zhuǎn)染的SKOV3)；采用PCR技術(shù)和Western blotting方法分別檢測三

7、組中THY1 mRNA及蛋白水平的表達，成功建立細胞轉(zhuǎn)染模型； 3.采用MTT及流式細胞術(shù)檢測SKOV3-THY1、SKOV3-Null和SKOV3三組中細胞周期、凋亡率及細胞增殖等生物學行為的變化；將三組細胞接種裸鼠皮下成瘤，建立雌性裸鼠異體移植卵巢癌模型，觀察瘤體生長速度及瘤體大小，免疫組化法檢測瘤體組織中THY1基因的蛋白表達，評價重組載體pcDNA3.1(+)-THY1對卵巢癌細胞SKOV3裸鼠體內(nèi)致瘤活性及生長活性的影

8、響。采用t檢驗和x<'2>檢驗進行統(tǒng)計分析。 結(jié)果：在免疫組化法檢測THY1蛋白在人卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達情況以及成功構(gòu)建重組載體pcDNA3.1(+)-THY1并建立SKOV3細胞重組載體轉(zhuǎn)染模型的基礎(chǔ)上，本研究發(fā)現(xiàn)： 1.THY1在正常卵巢、卵巢漿液性囊腺瘤及漿液性囊腺癌組織中的陽性表達率分別為60.0％(15/25)、72.0％(18/25)、34.0％(18/53)，IOD值分別為288449.1±6008

9、7.25、271655.5±66588.74、252087.5±45559.42，卵巢漿液性囊腺癌中THY1蛋白表達陽性率明顯低于正常卵巢和卵巢漿液性囊腺瘤組織(P<0.05)，且THY1表達量與卵巢漿液性囊腺癌的手術(shù).病理分期、組織學分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著負相關(guān)(P<0.05)； 2.利用酶切、PCR分析、DNA測序證實，重組載體即THY1真核表達載體pcDNA3.1(+)-THY1構(gòu)建成功；經(jīng)PCR和Western blot

10、ting證實，卵巢癌細胞SKOV3中無THY1的轉(zhuǎn)錄及翻譯，是進行THY1轉(zhuǎn)染的良好細胞模型，重組載體轉(zhuǎn)染SKOV3細胞后，經(jīng)PCR和Westernblotting證實轉(zhuǎn)染成功； 3.重組載體pcDNA3.1(+)-THY1轉(zhuǎn)染SKOV3細胞形成抗性克隆后，與未轉(zhuǎn)染組相比，G1期細胞比例明顯增多，S期細胞比例明顯減少，凋亡率明顯增高，細胞生長速度明顯減慢，細胞抑制率明顯增高，表明重組載體在體外能抑制SKOV3細胞增殖；建立雌性裸

11、鼠異體移植卵巢癌模型后，三組的成瘤潛伏期均為5天，4周后處死裸鼠發(fā)現(xiàn)，SKOV3-Null組細胞在裸鼠體內(nèi)生長較SKOV3-THY1組細胞生長快，兩組平均瘤體體積分別為340．74 mm<'3>、152．88 mm<'3>，抑瘤率為50．00％，瘤體組織內(nèi)THY1基因的蛋白表達陽性，而SKOV3-Null組和SKOV3組的蛋白表達陰性，表明重組載體在體內(nèi)能抑制SKOV3細胞增殖。 結(jié)論：THY1基因的缺失與卵巢漿液性囊腺癌的發(fā)生