雙環(huán)醇對H-,2-O-,2-誘導肝星狀細胞NF-κB活化調控機制的研究.pdf

1、慢性肝病是一類世界性的嚴重危害人類健康的疾病，預防肝纖維化的發(fā)生是這個過程的中間及關鍵環(huán)節(jié)，其中心事件是由于肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSCs）的激活導致細胞外基質（extracellular matrix，ECM），生成過多、降解相對不足。誘導活化的HSCs的凋亡可使肝纖維化發(fā)生逆轉。越來越多的研究認為HSCs的活化和增殖與其凋亡受到抑制有密切的關系，而核轉錄因子-κB（nuclear factor ka

2、ppa B，NF-κB）與細胞凋亡關系密切。
　　 NF-κB是由Rel蛋白家族p65和p50組成的同源或異源二聚體，其與一種NF-κB抑制物（inhibitor of κB，IκB），結合，存在于胞質內而無活性。NF-κB可以被多種刺激物所激活，如TNF-α、IL-1、脂多糖等，這些刺激物可以通過對IκBs的磷酸化而使其降解，并與NF-κB解離，暴露NF-κB的核識別位點，使其進入核內，促進下游的靶基因的轉錄。ItSCs的活化

3、伴有NF-κB的激活，并在活化中起著重要作用。在靜止態(tài)HSCs中NF-κB并無活性，但在激活態(tài)HSCs中，活性卻持續(xù)存在，因此有理由相信NF-κB可能通過抑制HSCs的凋亡而使活化的HSCs數(shù)量維持在相當?shù)乃?，最終導致肝纖維化的發(fā)生。
　　 研究表明，NF-κB的抑制劑有抗肝纖維化的作用，說明抑制NF-κB后能使肝纖維化發(fā)生逆轉。雙環(huán)醇（bicyclol）臨床應用于治療慢性乙型肝炎顯示較好的效果。近年研究表明雙環(huán)醇有抗肝纖維化

4、的作用，但其作用機制目前尚未明確。為此，本研究應用體外細胞培養(yǎng)技術，以H2O2激活HSCs NF-κB，研究雙環(huán)醇對NF-κB亞單位p65表達的抑制作用。
　　 目的：研究雙環(huán)醇對H2O2誘導的HSCsNF-κB活化調控機制。
　　 方法：采用體外細胞培養(yǎng)技術培養(yǎng)HSCs，以相同濃度的H2O2（2 μ mol/L）按時間梯度刺激細胞，應用RT-PCR方法檢測NF-κBp65 mRNA表達，Western blot法檢測N

5、F-κB p65蛋白表達情況。并用雙環(huán)醇預處理細胞后，觀察上述指標變化。
　　 結果：
　　 ①H2O2對HSCs NF-κB p65表達的影響：RT-PCR結果顯示，12h組、24h組mRNA表達量分別為1.32±0.08，2.15±0.21，與對照組0.53±0.12比較，表達量增加，P<0.05，有統(tǒng)計學差異；36h組mRNA表達量1.82±0.15與對照組0.53±0.12比較，表達量增加，P<0.05，有統(tǒng)計學

6、差異，與24h組2.15±0.21比較，表達量降低，P<0.05，有統(tǒng)計學差異。Western blot分析結果顯示，在大約56kD位置出現(xiàn)NF-κBp65特異性條帶。與正常對照組相比， NF-κBP65蛋白表達均增加，且隨作用時間變化而變化。12h組、24h組蛋白表達量分別為1.58±0.07，2.34±0.22，與對照組0.61±0.11比較，表達量增加， P<0.05，有統(tǒng)計學差異；36h組蛋白表達量1.92±0.15與對照組0.

7、6l±0.11比較，表達量增加，P<0.05，有統(tǒng)計學差異，與24h組2.34±0.22比較，表達量降低， P<0.05，有統(tǒng)計學差異。由此可見與正常對照組相比，NF-κB1965表達明顯升高后逐漸下降，表達于24h達高峰。因此下面的實驗應用終濃度為2.0umol/L H2O2作用HSCs 24h后收集細胞。
　　 ②不同濃度的雙環(huán)醇對H2O2誘導的HSCs NF-κB P65mRNA及蛋白表達的抑制作用。RT-PCR結果顯示，

8、0.3mmol/L組、0.5mmol/L組mRNA表達量分別為1.34±0.03，0.63±0.05，與對照組2.13±0.21比較，表達量降低，P<0.05，有統(tǒng)計學差異；1.0mmol/L組mRNA表達量0.59±0.17與對照組2.13±0.21比較，表達量降低，P<0.05，有統(tǒng)計學差異，與0.5mmol/L組0.63±0.05比較，表達量略有降低，但P>0.05，無統(tǒng)計學差異。Western blot分析結果顯示，在大約65k

9、D位置出現(xiàn)NF-κB p65特異性條帶。與對照組相比，NF-κB p65蛋白表達較對照組均降低，且隨作用濃度變化而變化。0.3mmol/L組、0.5mmol/L組蛋白表達量分別為1.41±0.06，0.70±0.12，與對照組2.35±0.19比較，表達量降低，P<0.05，有統(tǒng)計學差異；1.0mmol/L組蛋白表達量0.68±0.15與對照組2.35±0.19比較，表達量降低，P<0.05，有統(tǒng)計學差異，與0.5mmol/L組0.70

10、±0.12比較，表達量略減低，但P>0.05，無統(tǒng)計學差異。由此可見與正常對照組相比，NF-κB p65表達逐漸下降，于0.5mmol/L表達最低。
　　 ③不同時間的雙環(huán)醇對H2O2誘導的HSCs NF-κB p65的mRNA及蛋白表達的抑制作用。RT-PCR結果顯示，30min組、60min組mRNA表達量分別為1.31±0.05，0.74±0.18，與對照組2.16±0.20比較，表達量降低，P<0.05，有統(tǒng)計學差異；9

11、0min組mRNA表達量0.69±0.14與對照組2.16±0.20比較，表達量降低，P<0.05，有統(tǒng)計學差異，與60min組0.74±0.18比較，表達量略有降低，但P>0.05，無統(tǒng)計學差異。Western blot分析結果顯示，在大約65kD位置出現(xiàn)NF-κB p65特異性條帶。與對照組相比，0.5mmol/L不同時間作用于HSCs NF-κB p65條帶均變細，顏色均變淺。NF-κB p65蛋白表達較對照組均降低，且隨作用時間

12、變化而變化。30min組、60min組蛋白表達量分別為1.53±0.11，0.79±0.15，與對照組2.33±0.24比較，表達量降低，P<0.05，有統(tǒng)計學差異；90min組蛋白表達量0.77±0.19與對照組2.33±0.24比較，表達量降低，P<0.05，有統(tǒng)計學差異，與60min組0.79±0.15比較，表達量略降低，但P>0.05，無統(tǒng)計學差異。由此可見與正常對照組相比，NF-κB p65表達逐漸下降，于60min表達最低。

13、
　　 結論：
　　 ①H2O2可以引起HSCs NF-κB p65的活化，在相同濃度H2O2（2 μ mol/L）的作用下，NF-κB p65的mRNA及蛋白表達有時間依賴性，最大表達量的作用時間點為24h。
　　 ②H2O2對于HSCs NF-κB p65表達的調控作用可被雙環(huán)醇呈濃度、時間依賴的方式抑制，并與0.5mmol/L 60min抑制性最強，提示氧化應激可誘導NF-κB激活，雙環(huán)醇有抗氧化作用，這可