H-,2-O-,2-誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞凋亡以及凋亡后細(xì)胞外基質(zhì)代謝的變化.pdf

1、目的：肝纖維化是一個(gè)細(xì)胞外基質(zhì)沉積和降解失衡的病理過程；活化的肝星狀細(xì)胞(HSC)能分泌各種細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)等，通過旁分泌和自分泌的形式進(jìn)一步激活HSC，活化的HSC具有了收縮、增殖和分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)包括膠原，層粘連蛋白、蛋白聚糖等的功能；與此同時(shí)，分泌的能降解ECM的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)減少，而其抑制劑(TIMPs)增多，因此，HSC成為肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。

2、纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的。那么如何逆轉(zhuǎn)肝纖維化成為我們迫切要解決的問題。越來越多的研究表明：通過凋亡形式清除活化的HSC是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關(guān)鍵。誘導(dǎo)凋亡的途徑很多：如基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)，I型膠原的降解均可誘導(dǎo)HSC凋亡。因此，我們?cè)O(shè)想：如果MMPs增多，TIMP-1減少，膠原降解，一則可以促進(jìn)HSC凋亡；二則也可以降解多余的ECM，減輕纖維化程度。所以研究HSC凋亡后ECM是如何代謝的成為該設(shè)想的前提條件。 方法：含10％胎

3、牛血清的DMEM培養(yǎng)HSC-T6，傳代后換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分成對(duì)照組和模型組：對(duì)照組，N1：即正常HSC-T6，8小時(shí)后收獲；N2：正常HSC-T6，24小時(shí)收獲；N3：正常HSC-T6培養(yǎng)8小時(shí)后，更換新鮮的DMEM培養(yǎng)基，24小時(shí)收獲細(xì)胞。模型組，M1：加入濃度為100nmol/LH2O2，8小時(shí)收獲細(xì)胞；M2：加入濃度為100nmol/LH2O2，24小時(shí)收獲細(xì)胞；M3：加入濃度為100nmol/LH2O2，8小時(shí)后更換新鮮

4、的DMEM培養(yǎng)基，24小時(shí)收獲細(xì)胞。利用Anexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HSC凋亡。檢測(cè)不同凋亡程度時(shí)TIMPs、MMPs、及膠原的改變。在實(shí)驗(yàn)中，我們選取了3組不同凋亡水平的細(xì)胞(5％、58％、71％，編號(hào)為A、B、C)；利用半定量RT-PCR測(cè)定TIMP-1、TIMP-2、MMP-2、MMP-9、COL I、COLⅢ在mRNA水平的表達(dá)，利用western檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TIMP-1蛋白量的表達(dá)，利用明膠酶譜分析MMP-

5、2、MMP-9在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的蛋白水平表達(dá)。 結(jié)果：三個(gè)對(duì)照組收獲細(xì)胞的凋亡率分別是5.56％、13.75％、12.58％；三個(gè)模型組的凋亡率分別是35.78％、；71.98％、57.55％。 對(duì)不同凋亡程度時(shí)，TIMPs、MMPs、及膠原改變的研究表明：TIMP-1的含量B＞A＞C；TIMP-2 A≈B＞C；MMP-2B≈C＞A；MMP9 B≈C＞A；COL I A＞B＞C；COLⅢ A＞B＞C；且COL Ⅰ的變化梯

6、度＞COLⅢ； 討論:在HSC-T6自然凋亡過程中，N1與N2組，N1與N3組凋亡率的差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但N2與N3凋亡率的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；因此我們推斷：HSC-T6在培養(yǎng)過程中，凋亡率隨著時(shí)間增加而增加，而更換新鮮培養(yǎng)基(減少ECM、TIMPs、MMPs對(duì)HSC的影響)對(duì)凋亡無影響。 加入H2O2誘導(dǎo)HSC-T6凋亡后，M1、M2、M3三組凋亡率的差別兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即更換新鮮培養(yǎng)基(減少ECM、TIMPs

7、、MMPs對(duì)HSC的影響)能抑制H2O2誘導(dǎo)的HSC凋亡。對(duì)于此現(xiàn)象，我們有三個(gè)可能推斷：第一：MMPs誘導(dǎo)HSC凋亡的能力大于TIMPs抑制凋亡的能力；第二：MMPs的絕對(duì)數(shù)量大于TIMPs；第三：其他因素的影響如COL Ⅰ降解促進(jìn)凋亡等。 結(jié)論：ECM、TIMPs、MMPs的改變對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HSC凋亡有影響。對(duì)不同凋亡水平時(shí)ECM的代謝變化研究表明：凋亡早期：TIMP-1上升明顯，COLⅠ COLⅢ高表達(dá)，MMP-2、M