深部感染白念珠菌烯醇化酶表達(dá)分布研究.pdf

1、目的:烯醇化酶(Enolase，2-phospho-D-glycerate hydrolyase，ENO)是糖酵解途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶，催化2-磷酸甘油酯(2-PGA)至磷酸烯醇式丙酮酸酯的脫水反應(yīng);同樣，它也可催化糖異生中的逆反應(yīng)。它廣泛存在，包括細(xì)菌、真菌、果蠅、兩棲類、鳥(niǎo)類、植物和人類等;是白念珠菌中含量最為豐富的蛋白之一。白念珠菌基因組DNA中含有一個(gè)或兩個(gè)ENO編碼基因，克隆的cDNA有一連續(xù)的開(kāi)放讀碼框架，含1320bp，編碼4

2、40個(gè)氨基酸，與釀酒酵母(S.cerevisiae) ENO蛋白1和2的同源性分別為76％和78％，與人類ENO有60％同源性，預(yù)測(cè)蛋白分子量47，178Da，等電點(diǎn)5.6。根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)研究人們推測(cè):在白念珠菌侵入宿主組織和擴(kuò)散的過(guò)程中，白念珠菌ENO同樣可作為纖溶酶原等的受體，產(chǎn)生纖溶酶，促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)降解，破壞細(xì)胞自然屏障，促進(jìn)菌體穿過(guò)和損壞上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)白念珠菌在組織、器官中擴(kuò)散。由于烯醇化酶缺乏N段分泌信號(hào)，其存在菌體外

3、部一直存在爭(zhēng)議。應(yīng)用免疫電鏡方法分析體外培養(yǎng)的白念珠菌，顯示:ENO存在于白念珠菌酵母相和菌絲相的胞漿和細(xì)胞壁。迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)白念珠菌ENO的定位特征研究，以體外實(shí)驗(yàn)為主。念珠菌在深部組織器官感染過(guò)程中，其ENO的定位特征如何，至今未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。觀察感染深部組織的念珠菌ENO細(xì)胞定位特征對(duì)我們更好地理解ENO在念珠菌侵襲深部組織中的作用機(jī)制具有重要的意義。因此，本研究通過(guò)應(yīng)用釀酒酵母ENO建立抗白念珠菌ENO單克隆抗體，應(yīng)用免疫組化

4、方法分析深部感染組織中念珠菌ENO的定位特征。
　　 方法:
　　 1.ENO抗體的制備:ENO（來(lái)自釀酒酵母，Sigma產(chǎn)品）作為抗原與福氏完全佐劑充分混勻，免疫BALB/c小鼠，取脾細(xì)胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合。選出陽(yáng)性克隆，再進(jìn)行亞克隆，將穩(wěn)定分泌單克隆抗體的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，鑒定效價(jià)。取一定量雜交瘤細(xì)胞給BALB/c小鼠腹腔注射，約兩周后收集腹水。獲得相應(yīng)的IgG，進(jìn)行抗體效價(jià)、亞類和特異性鑒定。
　　

5、 2.建立系統(tǒng)念珠菌感染BALB/C小鼠模型:應(yīng)用環(huán)磷酰胺經(jīng)腹腔注射BALB/C小鼠。注射藥物后第4日，經(jīng)腹腔注射白念珠菌SC5314菌株孢子，觀察小鼠不同時(shí)間血液常規(guī)、腎臟真菌載量和心、肺、腎、腦、肝、脾等重要組織病理變化。
　　 3.體外培養(yǎng)白念珠菌的ENO表達(dá)定位特征:采用免疫組化法，用所制備的抗ENO單克隆抗體對(duì)體外培養(yǎng)的白念珠菌石蠟包埋組織進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。確定免疫組化法實(shí)驗(yàn)條件，并分析ENO的表達(dá)定位特點(diǎn)。
　　

6、 4.重要組織感染白念珠菌的ENO表達(dá)定位特征:采用免疫組化法，用所制備的抗ENO單克隆抗體，對(duì)系統(tǒng)念珠菌感染BALB/C小鼠模型的心、肺、腎、腦、肝、脾等重要組織石蠟包埋組織;和肺活檢組織白念珠菌培養(yǎng)陽(yáng)性、影像學(xué)證據(jù)支持的人類肺念珠菌感染病例的組織石蠟包埋組織進(jìn)行試驗(yàn)。分析深部組織器官內(nèi)白念珠菌ENO表達(dá)定位特點(diǎn)。
　　 結(jié)果:
　　 1.以釀酒酵母ENO為抗原，制備的抗ENO單克隆抗體19株，其中10E10株效價(jià)最高

7、，可達(dá)1(∶)4，096，000(ELISA)，并與天然白念珠菌ENO反應(yīng)。
　　 2.ENO在體外培養(yǎng)白念珠菌胞漿內(nèi)和胞壁都有表達(dá)存在，但以胞漿為主。
　　 3.ENO在系統(tǒng)念珠菌感染BALB/C小鼠模型的心、肺、腎、腦、肝、脾等重要組織的白念珠菌ENO在菌體胞漿內(nèi)和胞壁都有表達(dá)存在，但以胞壁為主。特別是在與組織緊貼的念珠菌其ENO表達(dá)定位于胞壁，而聚集的念珠菌其ENO則表達(dá)定位于胞漿。在人類肺念珠菌病組織內(nèi)白念珠菌E