實時熒光定量PCR技術在深部念珠菌感染早期診斷中的研究.pdf

1、近年來隨著廣譜抗生素、糖皮質激素和免疫抑制劑的廣泛應用，深部真菌感染的發(fā)病率和死亡率也呈逐年遞增的趨勢。大量臨床資料和經驗表明，深部真菌感染的療效與轉歸，很大程度上取決于早期診斷和治療。目前研究顯示住院患者中60％的深部真菌感染是由白念珠菌引起，且其在人體中是致病狀態(tài)還是定植狀態(tài)，與它的繁殖數(shù)量有關。同時發(fā)現(xiàn)非白念珠菌的檢出率已逐步增加，且耐藥性較高。因此，不僅要早期、快速診斷深部真菌病，還要在短時間內盡快鑒別致病菌，以選擇敏感有效的藥

2、物進行有效治療。 然而，臨床上深部真菌感染的診斷面臨著巨大的困難和挑戰(zhàn)，目前仍在沿用傳統(tǒng)方法，這些方法有耗時長、易污染、難定量等缺點，很大程度上制約了早期診斷和治療，延誤了最佳治療時機。 鑒于目前存在的問題，本課題擬在其他研究基礎上，利用實時熒光定量PCR技術中的熒光嵌合法為基本原理，設計白念珠菌特異性引物，利用白念珠菌標準菌株構建重組質粒建立標準品，不斷優(yōu)化熒光定量PCR實驗反應條件，繪制成白念珠菌的循環(huán)閾值(Ct)與

3、拷貝數(shù)log(Copy number)之間的標準曲線圖，其他待測樣品則根據其作為標準進行檢測定量，從而得以快速檢測并明確診斷。 同時，為了進一步快速鑒別五種常見念珠菌以選擇敏感有效的藥物進行治療。我們嘗試利用真菌通用引物，構建五種不同念珠菌的重組質粒作為標準品，對其進行實時熒光定量PCR檢測并分別得到五種念珠菌特異性的融解溫度。融解溫度與PCR擴增產物的序列有關，對于某一PCR擴增產物，其值是固定的。根據不同的融解溫度，使我們可

4、快速鑒別不同的致病菌種。 第一部分實時熒光定量PCR技術檢測白念珠菌方法的研究 目的：探索利用實時熒光定量PCR技術檢測白念珠菌的快速、可靠的新方法。 方法：在NCBI的Genbank中查找不同菌種的18SrRNA、5.8SrRNA、28SrRNA以及ITSⅠ、ITSⅡ基因序列，通過BLAST比對找出白念珠菌特異的基因序列，并保證此段高度保守。根據引物設計的原則，利用Primer5.0設計白念珠菌特異性引物，擴增

5、目的基因片段大約為270bp。應用特異性引物對白念珠菌標準菌株進行常規(guī)PCR，產物經1％瓊脂糖凝膠電泳，大約為270bp，紫光燈下切膠，試劑盒膠回收。將回收的片段與載體pMD18-T vector連接，構建白念珠菌重組質粒；將質粒轉化到DH5感受態(tài)細胞，在含氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上過夜篩選單克隆，提取重組克隆質粒，10μl白念珠菌重組質粒送至上海美孚公司進行測序鑒定，其余白念珠菌重組質粒-20℃保存?zhèn)溆脼闊晒舛縋CR標準品。將鑒定好

6、的白念珠菌重組質粒純化后，于紫外分光光度計上進行定量，根據重組質粒的堿基長度計算其分子質量，根據分子質量計算濃度，進而計算每微升所含的拷貝數(shù)，10倍稀釋成5×107-5×103濃度梯度。在最佳反應條件下，每個濃度平行加入3個反應管同時進行擴增，反應結束后計算機自動繪制標準曲線。 結果：白念珠菌重組質粒測定稀釋后，在最佳反應條件下進行定量擴增，得出了一條標準曲線及擴增曲線圖。從而可以得出循環(huán)閾值(Ct)與拷貝數(shù)log(Copynu

7、mber)之間的線性關系表達式：y=-3.385x+42.80。熒光定量PCR技術檢測白念珠菌最低能檢測到10個拷貝的基因，即相當于(1-5)CFU/ml，同時與其他真菌、細菌及病毒等無交叉陽性反應。 結論：實時熒光定量PCR技術檢測白念珠菌不僅具有較高的敏感性和特異性，而且可以對白念珠菌進行定量。 第二部分實時熒光定量PCR技術快速鑒別五種念珠菌方法的研究 目的：探索利用實時熒光定量PCR技術快速鑒別五種常見念

8、珠菌的方法。 方法：應用真菌通用引物ITS4和ITS86分別與白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌進行常規(guī)PCR，產物經1％瓊脂糖凝膠電泳，擴增目的基因片段分別約為300bp、360bp、260bp、248bp、214bp。紫光燈下切膠，試劑盒膠回收。分別將膠回收的片段與載體pMD18-T vector連接，構建五種不同念珠菌重組質粒；分別將五種不同念珠菌的質粒轉化到DH5感受態(tài)細胞，含氨芐抗性的LB固體培

9、養(yǎng)基上過夜篩選單克隆，提取重組克隆質粒，分別將10μl五種不同念珠菌重組質粒送至上海美孚公司進行測序鑒定，其余五種念珠菌重組質粒-20℃保存?zhèn)溆脼闊晒舛縋CR標準品。 將鑒定測序的五種念珠菌重組質粒純化后，于紫外分光光度計上進行定量，根據重組質粒的堿基長度計算其分子質量，根據分子質量計算濃度，進而計算每微升所含的拷貝數(shù)，分別10倍稀釋成1010-104濃度梯度。在最佳反應條件下，五種不同念珠菌按1010-104濃度梯度同時進行

10、擴增，連續(xù)進行8組相同反應，結束后計算機自動生成特異性的融解溫度和繪制融解曲線圖。 結果：五種不同的念珠菌重組質粒測定稀釋后，在最佳反應條件下進行熒光定量反應，自動生成融解溫度和融解曲線圖。該反應生成的融解溫度與PCR擴增產物的序列有關，對于某一PCR擴增產物，其值是固定的。通過分析融解溫度和融解曲線，可以確定PCR反應的特異性。五種不同的念珠菌有各自固定的融解溫度，根據該融解溫度的不同，可快速鑒別五種不同的念珠菌。 結