白念珠菌磷脂酶與對(duì)氟康唑耐藥關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、白念珠菌是人類(lèi)最常見(jiàn)的條件致病性真菌，亦是院內(nèi)感染的主要病原菌。目前，念珠菌感染性疾病呈日趨增高趨勢(shì)，且念珠菌血癥的病死率居高不下，深部白念珠菌感染病死率可高達(dá)67.9％，白念珠菌感染己成為院內(nèi)感染特別是免疫缺陷病患者最主要死因之一。隨著抗真菌藥物的大量應(yīng)用，真菌耐藥的情況變得越來(lái)越嚴(yán)重，特別是對(duì)常用唑類(lèi)藥物的耐藥，有研究顯示15.5％乃至更高的白念珠菌對(duì)氟康唑耐藥，這給有效控制日益增高的念珠菌感染帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。
　　 白念珠菌

2、耐藥與其毒力因子之間存在重要關(guān)系，耐藥株通常較敏感株毒力強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)耐藥基因CDR1斷裂突變的白念珠菌毒力明顯下降，毒力增強(qiáng)的耐藥菌株可有耐藥基因CDR和MDR的過(guò)度表達(dá)。且念珠菌菌絲相形成能力和耐藥之間存在一種正相關(guān)關(guān)系。隨著白念珠菌對(duì)氟康唑耐藥性的出現(xiàn)，其分泌蛋白酶和磷脂酶等毒力因子的能力亦同時(shí)增加。因此研究白念珠菌毒力因子與耐藥發(fā)生間的關(guān)系，降低念珠菌毒力與致病性，防止念珠菌耐藥的發(fā)生，最終有效控制念珠菌感染是21世紀(jì)面臨的重大科

3、研任務(wù)。
　　 念珠菌致病性與其毒力因子密切相關(guān)，念珠菌通過(guò)黏附來(lái)識(shí)別宿主，通過(guò)其利于侵入的酶增強(qiáng)毒力，通過(guò)形態(tài)發(fā)生及酵母相與菌絲相之間的轉(zhuǎn)換使其利于侵入宿主，并對(duì)該微生物的適應(yīng)性有利。因此，念珠菌毒力因子包括黏附素、利于侵入的酶、形態(tài)發(fā)生及表型轉(zhuǎn)換等。其中細(xì)胞外磷脂酶是念珠菌入侵組織的重要毒力因子，它作用于分子中不同酯健，使甘油磷脂形成溶血磷脂從而引起組織細(xì)胞損傷。磷脂酶包括A、B、C、D四種類(lèi)型，磷脂酶A有促進(jìn)白念珠菌引發(fā)炎

4、癥的作用，磷脂酶C和D與白念珠菌表型轉(zhuǎn)換和信息傳遞有關(guān)，磷脂酶B主要通過(guò)分解宿主細(xì)胞膜磷脂而引起膜的通透性增高和完整性受損，繼而促進(jìn)白念珠菌的早期入侵。磷脂酶B又分為磷脂酶B1和磷脂酶B2，磷脂酶B1是一種分泌型糖蛋白，分子量為84KD，由605個(gè)氨基酸組成，它同時(shí)具有水解酶和溶血磷脂轉(zhuǎn)酰酶的活性，研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)PLB1基因敲除的白念珠菌菌株在體外產(chǎn)生的磷脂酶減少且致病性降低，PLB1是念珠菌致病所必需的毒力因子。
　　 唑類(lèi)抗真

5、菌藥物主要通過(guò)抑制14α-去甲基化酶活性作用影響14α去甲基化，從而使麥角固醇的合成受阻，導(dǎo)致真菌細(xì)胞膜的完整性受損而發(fā)揮抗真菌作用?；颊叩募?xì)胞免疫功能缺陷，藥物的反復(fù)應(yīng)用，機(jī)體的感染狀況及可能存在的耐藥遺傳性等相關(guān)因素均可誘導(dǎo)耐藥的發(fā)生。唑類(lèi)的耐藥機(jī)制主要包括藥物流出泵的過(guò)度表達(dá)，藥物靶酶的突變和過(guò)度表達(dá)，生物被膜的形成及念珠菌細(xì)胞內(nèi)濾泡對(duì)藥物分子的扣押機(jī)制等。但亦有研究發(fā)現(xiàn)有些MIC值較高的菌株，毒力因子的活性卻降低。毒力高的菌株所

6、致感染易于控制，而毒力低的菌株對(duì)FCZ的治療出現(xiàn)耐藥。念珠菌耐藥與其毒力因子間存在復(fù)雜的相互關(guān)系，
　　 目前，有關(guān)念珠菌磷脂酶與耐藥發(fā)生關(guān)系的研究報(bào)道國(guó)內(nèi)外并不多見(jiàn)，國(guó)內(nèi)報(bào)道通過(guò)誘導(dǎo)使白念珠菌耐藥，進(jìn)而研究比較耐藥菌株、誘導(dǎo)耐藥菌株、敏感菌株磷脂酶、蛋白酶活性及致病性強(qiáng)弱的報(bào)道。而從分子水平研究磷脂酶B與耐藥的關(guān)系目前還是空白。本研究擬通過(guò)M27-A方案篩選白念珠菌耐藥菌株和敏感菌株，研究其磷脂酶活性和致病性的不同，并進(jìn)一步研

7、究?jī)山M磷脂酶B1的mRNA和蛋白表達(dá)的不同，為磷脂酶在耐藥發(fā)生中的作用提供研究基礎(chǔ)，以期最終能夠有效控制念珠菌耐藥和感染的發(fā)生。
　　 目的：
　　 1.通過(guò)蛋黃平板法研究白念珠菌耐藥菌株和敏感菌株磷脂酶活性的差異。
　　 2.通過(guò)動(dòng)物毒力試驗(yàn)比較白念珠菌耐藥菌株和敏感菌株致病性的強(qiáng)弱。
　　 3.通過(guò)RT-PCR比較研究?jī)山M間磷脂酶B1轉(zhuǎn)錄水平mRNA表達(dá)的差異。
　　 4.通過(guò)Western

8、blot法比較研究?jī)山M間磷脂酶B1蛋白表達(dá)水平的差異。
　　 方法：
　　 1.白念珠菌氟康唑耐藥菌株與敏感菌株的篩選實(shí)驗(yàn)用白念珠菌均分離自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院門(mén)診患者，經(jīng)血清芽管試驗(yàn)、厚壁孢子試驗(yàn)和YBC酵母鑒定卡鑒定試驗(yàn)證實(shí)為白念珠菌。根據(jù)NCCLS制訂的M27-A方案中的操作步驟進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，氟康唑藥物濃度范圍0.125μg/mL-64μg/mL，接種菌量為0.5-2.5×103CFU/mL，35℃培養(yǎng)48h判定結(jié)果。

9、
　　 2.磷脂酶活性的測(cè)定制備5×107CFU/mL菌懸液，微量移液器移取配好的菌懸液10μL滴于蛋黃平皿表面，每株菌測(cè)定兩份，將平皿密封后置35℃培養(yǎng)48h觀察結(jié)果。測(cè)量菌落直徑及沉淀圈直徑，利用菌落直徑與沉淀圈直徑的比值(Pz值)來(lái)定量表示磷脂酶的活性，Pz=菌落直徑/總直徑(菌落直徑+沉淀圈直徑)，Pz值愈低，菌株磷脂酶活性就愈強(qiáng)，Pz值=1.0時(shí)表示磷脂酶活性陰性。
　　 3.耐藥菌株與敏感菌株對(duì)小白鼠致病性的

10、對(duì)比研究清潔級(jí)小白鼠30只，隨機(jī)分成耐藥組和敏感組，每組15只。制備敏感菌株和耐藥菌株菌懸液，濃度為1-1.5×107CFU/mL。分別于尾靜脈注射感染小鼠，注射菌量為0.2mL，觀察30d內(nèi)小鼠存活天數(shù)，計(jì)算比較兩組小鼠的死亡率和平均存活期。
　　 4.RT-PCR檢測(cè)耐藥菌株與敏感菌株磷脂酶B1 mRNA的表達(dá)應(yīng)用E.Z.N.A Yeast RNA Kit試劑盒提取白念珠菌總RNA，具體步驟樣嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。分光光度計(jì)測(cè)

11、定A260/A280，檢測(cè)其濃度和純度。以5‘一TCACCAACGCCATAAGTCC-3'，5'-CATCTTCTTCAACAGCAGCTTG-3'為磷脂酶B1引物，EFB1為內(nèi)參照，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性45sec，58℃退火45sec，72℃延伸45sec。35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增目的基因，72℃終延伸7min。取10μLPCR產(chǎn)物，1.5％瓊脂糖凝膠電泳20min，EB顯色，Gel

12、Dos2000凝膠圖像系統(tǒng)成像，Molecular Analyst圖像分析軟件分析擴(kuò)增條帶的亮度，磷脂酶B1mRNA表達(dá)的相對(duì)系數(shù)=目的基因強(qiáng)度/EFB1基因強(qiáng)度。
　　 5.Western blot檢測(cè)耐藥菌株和敏感菌株磷脂酶B1蛋白表達(dá)的不同實(shí)驗(yàn)用菌株接種于50mL改良YPD培養(yǎng)基中，接種菌量為6×106CFU/mL，35℃、200rpm搖床培養(yǎng)12h。離心吸取上清液過(guò)濾，鹽析法提取胞外蛋白，P0013B強(qiáng)RIPA裂解液裂解

13、提取細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜上，封閉液室溫下振蕩封閉2h。分別加入一抗(1∶500內(nèi)參照β-actin抗體、1∶3000磷脂酶B1抗體)與胞外磷脂酶B1蛋白、胞內(nèi)磷脂酶B1蛋白及β-actin結(jié)合，在培養(yǎng)皿中4℃反應(yīng)過(guò)夜，洗膜液洗膜。分別加入HRP標(biāo)記的抗鼠二抗(1∶1250)反應(yīng)液，室溫下振蕩反應(yīng)2h，洗膜液洗膜。應(yīng)用ECL試劑盒顯影、定影。凝膠成像系統(tǒng)成像。用TotalL

14、abl.0軟件進(jìn)行半定量分析各條帶的相對(duì)吸光值，以各目的條帶的IOD與β-actin的IOD比值代表其蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　 結(jié)果：
　　 1.藥敏試驗(yàn)結(jié)果與生長(zhǎng)對(duì)照孔相比將濁度被抑制80％以上孔的藥物濃度判定為MIC值，篩選出氟康唑耐藥菌株(MIC＞64μg/mL)及敏感菌株(MIC＜8μg/mL)各15株。
　　 2.耐藥組和敏感組磷脂酶活性比較15株耐藥菌中12株產(chǎn)生特異沉淀圈，磷脂酶陽(yáng)性率為80.0％，

15、Pz值為0.786±0.055；敏感菌株中7株產(chǎn)生特異沉淀圈，陽(yáng)性率為46.7％，Pz值為0.913±0.078。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)兩者磷脂酶活性有顯著性差異，P＜0.01，耐藥菌株磷脂酶活性明顯強(qiáng)于敏感菌株。
　　 3.耐藥組和敏感組小鼠平均存活期比較耐藥組小鼠30d內(nèi)死亡12只，敏感組小鼠30d內(nèi)死亡6只。耐藥組和敏感組小鼠的死亡率分別為80％和40％。兩組小鼠死亡率和平均存活天數(shù)之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。耐藥菌株對(duì)小鼠

16、的致病性明顯強(qiáng)于敏感菌株。
　　 4.耐藥菌株與敏感菌株磷脂酶B1mRNA表達(dá)水平的比較提取白念珠菌總RNA，檢測(cè)0D260/OD280比值在1.8-2.0范圍內(nèi)，總RNA濃度和純度符合試驗(yàn)要求。RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增耐藥菌株和敏感菌株磷脂酶B1基因和內(nèi)參照EFB1基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物符合相應(yīng)目的基因片段大小，預(yù)期目的基因片段大小約311bp。MolecularAnalyst軟件分析并計(jì)算耐藥菌株和敏感菌株磷脂酶B1的mRNA相對(duì)

17、表達(dá)強(qiáng)度，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)顯示耐藥組和敏感組磷脂酶B1mRNA表達(dá)有顯著性差異，P＜0.05，耐藥菌株磷脂酶B1mRNA表達(dá)強(qiáng)于敏感菌株。
　　 5.Western blot比較白念珠菌耐藥菌株和敏感菌株磷脂酶B1蛋白表達(dá)水平以β-actin為內(nèi)參照，白念珠菌耐藥菌株胞內(nèi)和胞外PLB1蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.4145±0.2773和0.2720±0.2194，敏感菌株為0.1825±0.1831和0.0688±0.0631。耐藥菌株胞內(nèi)和