白念珠菌磷脂酶與對氟康唑耐藥關(guān)系的實驗研究.pdf

1、白念珠菌是人類最常見的條件致病性真菌，亦是院內(nèi)感染的主要病原菌。目前，念珠菌感染性疾病呈日趨增高趨勢，且念珠菌血癥的病死率居高不下，深部白念珠菌感染病死率可高達(dá)67.9％，白念珠菌感染己成為院內(nèi)感染特別是免疫缺陷病患者最主要死因之一。隨著抗真菌藥物的大量應(yīng)用，真菌耐藥的情況變得越來越嚴(yán)重，特別是對常用唑類藥物的耐藥，有研究顯示15.5％乃至更高的白念珠菌對氟康唑耐藥，這給有效控制日益增高的念珠菌感染帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。
　　 白念珠菌

2、耐藥與其毒力因子之間存在重要關(guān)系，耐藥株通常較敏感株毒力強。研究發(fā)現(xiàn)耐藥基因CDR1斷裂突變的白念珠菌毒力明顯下降，毒力增強的耐藥菌株可有耐藥基因CDR和MDR的過度表達(dá)。且念珠菌菌絲相形成能力和耐藥之間存在一種正相關(guān)關(guān)系。隨著白念珠菌對氟康唑耐藥性的出現(xiàn)，其分泌蛋白酶和磷脂酶等毒力因子的能力亦同時增加。因此研究白念珠菌毒力因子與耐藥發(fā)生間的關(guān)系，降低念珠菌毒力與致病性，防止念珠菌耐藥的發(fā)生，最終有效控制念珠菌感染是21世紀(jì)面臨的重大科

3、研任務(wù)。
　　 念珠菌致病性與其毒力因子密切相關(guān)，念珠菌通過黏附來識別宿主，通過其利于侵入的酶增強毒力，通過形態(tài)發(fā)生及酵母相與菌絲相之間的轉(zhuǎn)換使其利于侵入宿主，并對該微生物的適應(yīng)性有利。因此，念珠菌毒力因子包括黏附素、利于侵入的酶、形態(tài)發(fā)生及表型轉(zhuǎn)換等。其中細(xì)胞外磷脂酶是念珠菌入侵組織的重要毒力因子，它作用于分子中不同酯健，使甘油磷脂形成溶血磷脂從而引起組織細(xì)胞損傷。磷脂酶包括A、B、C、D四種類型，磷脂酶A有促進(jìn)白念珠菌引發(fā)炎

4、癥的作用，磷脂酶C和D與白念珠菌表型轉(zhuǎn)換和信息傳遞有關(guān)，磷脂酶B主要通過分解宿主細(xì)胞膜磷脂而引起膜的通透性增高和完整性受損，繼而促進(jìn)白念珠菌的早期入侵。磷脂酶B又分為磷脂酶B1和磷脂酶B2，磷脂酶B1是一種分泌型糖蛋白，分子量為84KD，由605個氨基酸組成，它同時具有水解酶和溶血磷脂轉(zhuǎn)酰酶的活性，研究發(fā)現(xiàn)一個PLB1基因敲除的白念珠菌菌株在體外產(chǎn)生的磷脂酶減少且致病性降低，PLB1是念珠菌致病所必需的毒力因子。
　　 唑類抗真

5、菌藥物主要通過抑制14α-去甲基化酶活性作用影響14α去甲基化，從而使麥角固醇的合成受阻，導(dǎo)致真菌細(xì)胞膜的完整性受損而發(fā)揮抗真菌作用。患者的細(xì)胞免疫功能缺陷，藥物的反復(fù)應(yīng)用，機體的感染狀況及可能存在的耐藥遺傳性等相關(guān)因素均可誘導(dǎo)耐藥的發(fā)生。唑類的耐藥機制主要包括藥物流出泵的過度表達(dá)，藥物靶酶的突變和過度表達(dá)，生物被膜的形成及念珠菌細(xì)胞內(nèi)濾泡對藥物分子的扣押機制等。但亦有研究發(fā)現(xiàn)有些MIC值較高的菌株，毒力因子的活性卻降低。毒力高的菌株所

6、致感染易于控制，而毒力低的菌株對FCZ的治療出現(xiàn)耐藥。念珠菌耐藥與其毒力因子間存在復(fù)雜的相互關(guān)系，
　　 目前，有關(guān)念珠菌磷脂酶與耐藥發(fā)生關(guān)系的研究報道國內(nèi)外并不多見，國內(nèi)報道通過誘導(dǎo)使白念珠菌耐藥，進(jìn)而研究比較耐藥菌株、誘導(dǎo)耐藥菌株、敏感菌株磷脂酶、蛋白酶活性及致病性強弱的報道。而從分子水平研究磷脂酶B與耐藥的關(guān)系目前還是空白。本研究擬通過M27-A方案篩選白念珠菌耐藥菌株和敏感菌株，研究其磷脂酶活性和致病性的不同，并進(jìn)一步研

7、究兩組磷脂酶B1的mRNA和蛋白表達(dá)的不同，為磷脂酶在耐藥發(fā)生中的作用提供研究基礎(chǔ)，以期最終能夠有效控制念珠菌耐藥和感染的發(fā)生。
　　 目的：
　　 1.通過蛋黃平板法研究白念珠菌耐藥菌株和敏感菌株磷脂酶活性的差異。
　　 2.通過動物毒力試驗比較白念珠菌耐藥菌株和敏感菌株致病性的強弱。
　　 3.通過RT-PCR比較研究兩組間磷脂酶B1轉(zhuǎn)錄水平mRNA表達(dá)的差異。
　　 4.通過Western

8、blot法比較研究兩組間磷脂酶B1蛋白表達(dá)水平的差異。
　　 方法：
　　 1.白念珠菌氟康唑耐藥菌株與敏感菌株的篩選實驗用白念珠菌均分離自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院門診患者，經(jīng)血清芽管試驗、厚壁孢子試驗和YBC酵母鑒定卡鑒定試驗證實為白念珠菌。根據(jù)NCCLS制訂的M27-A方案中的操作步驟進(jìn)行藥敏試驗，氟康唑藥物濃度范圍0.125μg/mL-64μg/mL，接種菌量為0.5-2.5×103CFU/mL，35℃培養(yǎng)48h判定結(jié)果。

9、
　　 2.磷脂酶活性的測定制備5×107CFU/mL菌懸液，微量移液器移取配好的菌懸液10μL滴于蛋黃平皿表面，每株菌測定兩份，將平皿密封后置35℃培養(yǎng)48h觀察結(jié)果。測量菌落直徑及沉淀圈直徑，利用菌落直徑與沉淀圈直徑的比值(Pz值)來定量表示磷脂酶的活性，Pz=菌落直徑/總直徑(菌落直徑+沉淀圈直徑)，Pz值愈低，菌株磷脂酶活性就愈強，Pz值=1.0時表示磷脂酶活性陰性。
　　 3.耐藥菌株與敏感菌株對小白鼠致病性的

10、對比研究清潔級小白鼠30只，隨機分成耐藥組和敏感組，每組15只。制備敏感菌株和耐藥菌株菌懸液，濃度為1-1.5×107CFU/mL。分別于尾靜脈注射感染小鼠，注射菌量為0.2mL，觀察30d內(nèi)小鼠存活天數(shù)，計算比較兩組小鼠的死亡率和平均存活期。
　　 4.RT-PCR檢測耐藥菌株與敏感菌株磷脂酶B1 mRNA的表達(dá)應(yīng)用E.Z.N.A Yeast RNA Kit試劑盒提取白念珠菌總RNA，具體步驟樣嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。分光光度計測

11、定A260/A280，檢測其濃度和純度。以5‘一TCACCAACGCCATAAGTCC-3'，5'-CATCTTCTTCAACAGCAGCTTG-3'為磷脂酶B1引物，EFB1為內(nèi)參照，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性45sec，58℃退火45sec，72℃延伸45sec。35個循環(huán)擴(kuò)增目的基因，72℃終延伸7min。取10μLPCR產(chǎn)物，1.5％瓊脂糖凝膠電泳20min，EB顯色，Gel

12、Dos2000凝膠圖像系統(tǒng)成像，Molecular Analyst圖像分析軟件分析擴(kuò)增條帶的亮度，磷脂酶B1mRNA表達(dá)的相對系數(shù)=目的基因強度/EFB1基因強度。
　　 5.Western blot檢測耐藥菌株和敏感菌株磷脂酶B1蛋白表達(dá)的不同實驗用菌株接種于50mL改良YPD培養(yǎng)基中，接種菌量為6×106CFU/mL，35℃、200rpm搖床培養(yǎng)12h。離心吸取上清液過濾，鹽析法提取胞外蛋白，P0013B強RIPA裂解液裂解

13、提取細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜上，封閉液室溫下振蕩封閉2h。分別加入一抗(1∶500內(nèi)參照β-actin抗體、1∶3000磷脂酶B1抗體)與胞外磷脂酶B1蛋白、胞內(nèi)磷脂酶B1蛋白及β-actin結(jié)合，在培養(yǎng)皿中4℃反應(yīng)過夜，洗膜液洗膜。分別加入HRP標(biāo)記的抗鼠二抗(1∶1250)反應(yīng)液，室溫下振蕩反應(yīng)2h，洗膜液洗膜。應(yīng)用ECL試劑盒顯影、定影。凝膠成像系統(tǒng)成像。用TotalL

14、abl.0軟件進(jìn)行半定量分析各條帶的相對吸光值，以各目的條帶的IOD與β-actin的IOD比值代表其蛋白的相對表達(dá)量。
　　 結(jié)果：
　　 1.藥敏試驗結(jié)果與生長對照孔相比將濁度被抑制80％以上孔的藥物濃度判定為MIC值，篩選出氟康唑耐藥菌株(MIC＞64μg/mL)及敏感菌株(MIC＜8μg/mL)各15株。
　　 2.耐藥組和敏感組磷脂酶活性比較15株耐藥菌中12株產(chǎn)生特異沉淀圈，磷脂酶陽性率為80.0％，

15、Pz值為0.786±0.055；敏感菌株中7株產(chǎn)生特異沉淀圈，陽性率為46.7％，Pz值為0.913±0.078。統(tǒng)計學(xué)檢驗兩者磷脂酶活性有顯著性差異，P＜0.01，耐藥菌株磷脂酶活性明顯強于敏感菌株。
　　 3.耐藥組和敏感組小鼠平均存活期比較耐藥組小鼠30d內(nèi)死亡12只，敏感組小鼠30d內(nèi)死亡6只。耐藥組和敏感組小鼠的死亡率分別為80％和40％。兩組小鼠死亡率和平均存活天數(shù)之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。耐藥菌株對小鼠

16、的致病性明顯強于敏感菌株。
　　 4.耐藥菌株與敏感菌株磷脂酶B1mRNA表達(dá)水平的比較提取白念珠菌總RNA，檢測0D260/OD280比值在1.8-2.0范圍內(nèi)，總RNA濃度和純度符合試驗要求。RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增耐藥菌株和敏感菌株磷脂酶B1基因和內(nèi)參照EFB1基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物符合相應(yīng)目的基因片段大小，預(yù)期目的基因片段大小約311bp。MolecularAnalyst軟件分析并計算耐藥菌株和敏感菌株磷脂酶B1的mRNA相對

17、表達(dá)強度，統(tǒng)計學(xué)檢驗顯示耐藥組和敏感組磷脂酶B1mRNA表達(dá)有顯著性差異，P＜0.05，耐藥菌株磷脂酶B1mRNA表達(dá)強于敏感菌株。
　　 5.Western blot比較白念珠菌耐藥菌株和敏感菌株磷脂酶B1蛋白表達(dá)水平以β-actin為內(nèi)參照，白念珠菌耐藥菌株胞內(nèi)和胞外PLB1蛋白相對表達(dá)量為0.4145±0.2773和0.2720±0.2194，敏感菌株為0.1825±0.1831和0.0688±0.0631。耐藥菌株胞內(nèi)和