白念珠菌磷酶酶B的原核表達、純化及功能驗證.pdf

1、背景：白念珠菌是一種重要的人類致病真菌,可引起機體淺部和深部的廣泛損害,毒力因子包括黏附素、利于侵入的酶、形態(tài)發(fā)生及表型轉換、受體等幾個方面。其中磷脂酶B是白念珠菌重要的毒力因子,與白念珠菌致病有直接關系即在白念珠菌入侵宿主的早期發(fā)揮作用,包括對上皮細胞的黏附、入侵和損傷。磷脂酶B與白念珠菌感染密切相關,其在感染過程中的作用逐漸受到重視,并逐漸成為研究熱點。
　　 目的：構建磷脂酶B1和B2的重組表達體,在大腸桿菌中進行誘導表達

2、,純化表達產(chǎn)物并進行生物活性檢測,為探索磷脂酶B1和B2重組蛋白的致病和耐藥機制奠定基礎,也為研制新型抗真菌藥物、診斷試劑及抗真菌疫苗等提供理論基礎及科學依據(jù)。
　　 方法：從白念珠菌中提取基因組DNA為模板,用PCR方法獲取磷脂酶B1和B2基因。將原核表達載體pEGX-4T-1分別與磷脂酶B1和B2基因行雙酶切,瓊脂糖凝膠純化,連接酶切產(chǎn)物,轉化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細菌,篩選菌落和測序鑒定。將重組原核表達載體pEGX-4T

3、-1/PLB1和pEGX-4T-1/PLB2轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞,在37℃經(jīng)IPTG誘導表達出包涵體融合蛋白。包涵體蛋白尿素中變性復性后經(jīng)親和層析、陰離子交換層析和反相高效液相層析純化,并用凝血酶酶切標簽,得到純化的磷脂酶B1和B2蛋白,并通過凝膠擴散法檢測其生物學活性。
　　 結果：經(jīng)PCR擴增獲得的目的基因分子量與預計相同,并定向插入原核表達載體pEGX-4T-1中,雙酶切后電泳獲得預期的磷脂酶B1和B2

4、基因條帶,測序證實為正確序列。重組原核表達載體pEGX-4T-1/PLB1和pEGX-4T-1/PLB2的基因工程菌在37℃經(jīng)IPTG誘導后均表達出包涵體融合蛋白,其在尿素中變性復性后經(jīng)純化、酶切后得到目的蛋白,并驗證其具有生物學活性。
　　 結論：⑴成功構建了pEGX-4T-1/PLB1和pEGX-4T-1/PLB2原核表達載體,將其轉化至大腸桿菌后表達出磷脂酶B1和B2的重組蛋白；⑵重組蛋白變性、復性后經(jīng)親和層析等純化及凝血