丁酸鈉誘導(dǎo)未成熟樹突狀細(xì)胞分化及其免疫學(xué)功能研究.pdf

1、近年來，器官移植做為治療終末期臟器功能衰竭的最佳手段，取得了令人矚目的成績。隨著外科技術(shù)的日臻成熟和新型免疫抑制劑的應(yīng)用，移植器官的存活時間明顯延長，器官移植已廣泛開展。目前以免疫抑制劑為主的很多藥物能較好的防治移植排斥反應(yīng)，保證移植物在一定時間內(nèi)的存活，但這些藥物往往具有誘發(fā)腫瘤、機(jī)會菌感染、移植物散失功能等毒副作用，而且價格昂貴需終身服藥，給患者的生理、心理及經(jīng)濟(jì)上帶來沉重壓力。同種移植排斥仍是目前器官移植領(lǐng)域所遇到的最大難題。因此

2、，研究移植排斥反應(yīng)機(jī)理及如何有效控制移植排斥反應(yīng)，是提高器官移植成功率的關(guān)鍵；而誘導(dǎo)受體抗原特異性免疫耐受是同種器官移植追求的目標(biāo)。在誘導(dǎo)免疫耐受過程中一個重要的決定因素是抗原遞呈細(xì)胞(Antigen presenting cells，APC)的狀態(tài)，而樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DC)做為一類功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞，在識別和遞呈抗原、啟動免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)移植排斥反應(yīng)中起著重要的作用。DC成熟狀態(tài)的不同不僅決定著T細(xì)胞

3、的激活，而且還決定了T細(xì)胞免疫應(yīng)答的最終發(fā)展方向。而采用不成熟DC是有效誘導(dǎo)移植免疫耐受的方法之一。 表觀遺傳學(xué)(Epigenetics)是指研究基因組DNA序列不變的情況下在表型上具有穩(wěn)定的、可遺傳的(或有潛在可遺傳性質(zhì))的變化。在各種組蛋白修飾中，組蛋白乙?；揎椩诨蚧钚缘恼{(diào)節(jié)中扮演著重要的角色。組蛋白乙?；腿ヒ阴；謩e由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(Histone acetyltransferases，HAT)和組蛋白去乙?；?/p>

4、(Histone deacetylases，HDAC)催化完成，是一個動態(tài)的過程。丁酸鈉(Sodium butyrate)是一個天然的HDAC抑制劑(Histone deacetylasesinhibitor，HADCi)，研究表明丁酸鈉可以顯著的影響PMBC來源的分化和成熟過程，并誘導(dǎo)其處于不成熟狀態(tài)，從而誘發(fā)機(jī)體抗原特異性免疫耐受方面。研究發(fā)現(xiàn)，DC產(chǎn)生的不同免疫效應(yīng)與其所處的狀態(tài)和微環(huán)境密切有關(guān)，而吲哚胺2,3雙加氧酶(Indol

5、eamine 2，3-dioxygense，IDO)是一種主要存在于APC中的含有血紅素的細(xì)胞內(nèi)酶，是色氨酸向犬尿氨酸和喹啉酸的降解過程中的限速酶，可能在DC誘導(dǎo)免疫耐受的途徑中發(fā)揮了重要的作用。細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)是由細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的，JAK—STAT信號通路中非常重要的負(fù)調(diào)控蛋白，通過抑制細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)機(jī)體對細(xì)胞因子的過度刺激。許多研究也表明S

6、OCS是固有免疫和獲得性免疫中非常重要的生理性調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以促進(jìn)或抑制樹突狀細(xì)胞的激活，并參與T細(xì)胞的分化和免疫調(diào)控。 本研究的目的：(1)通過不同濃度丁酸鈉和不同培養(yǎng)時間體外誘導(dǎo)PMBC為未成熟DC，探討制備未成熟DC的新方法，并為進(jìn)一步深入研究DC分化過程中的表觀遺傳學(xué)機(jī)制提供依據(jù)。(2)探討丁酸鈉對未成熟樹突狀細(xì)胞IDO、SOCS-1、SOCS-2、SOCS-3表達(dá)的調(diào)控，揭示丁酸鈉誘導(dǎo)的未成熟DC在免疫耐受中的作用與分子

7、機(jī)制。 第1章丁酸鈉誘導(dǎo)未成熟樹突狀細(xì)胞的分化及其免疫學(xué)特性研究　　1.研究方法抽取健康志愿者(n=5)外周血分離單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，將PBMC密度調(diào)到5×109cells/L，加入25cm2培養(yǎng)瓶，37℃、5％CO2培養(yǎng)2h后，洗去非貼壁細(xì)胞。貼壁細(xì)胞用含1×106U/L rhGM—CSF和5×105U/L人重組IL-4的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)

8、，第3d全量換液。第6d時收獲未成熟DC，按1×106 cells/孔接種24孔板，每孔體積1ml，加入含rhGM-CSF和IL-4的完全培養(yǎng)液，并分組誘導(dǎo)DC分化。(1)對照組，僅用含rhGM-CSF和IL-4的完全培養(yǎng)液，不加促成熟因子LPS；(2)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)組，加入LPS 1mg/L；(3)組：丁酸鈉誘導(dǎo)組，丁酸鈉誘導(dǎo)組按照丁酸鈉濃度的不同，分為3組分別誘導(dǎo)。A組：加入丁酸鈉1.0 mmol/L；B組：加入丁酸鈉0.75

9、 mmol/L；C組：加入丁酸鈉0.5 mmol/L;(4)組：丁酸鈉、脂多糖混合誘導(dǎo)組，加入丁酸鈉1.0 mmol/L和LPS 1 mg/L同時誘導(dǎo)分化。各組在誘導(dǎo)24h和48h后分別收獲DC，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表型分析；并采用Annexin V/PI雙染色法進(jìn)行細(xì)胞凋完的流式檢測。同時收集培養(yǎng)上清，-80℃保存，用于檢測IL-12(p40)、IL-10、IFN-γ含量。 2.結(jié)果在丁酸鈉誘導(dǎo)下，各組DC表面的成熟標(biāo)志(CD80、CD

10、83、CD86)均顯著下調(diào)，丁酸鈉濃度越高下調(diào)越明顯，隨著培養(yǎng)時間的延長，各組DC表面的成熟標(biāo)志均顯著下調(diào)；但是細(xì)胞的凋亡率也同時上升。負(fù)性調(diào)節(jié)表型中LPS誘導(dǎo)組DC表達(dá)TLR3、TLR-4明顯低于丁酸鈉誘導(dǎo)組；而B7-H1、B7-DC則均明顯高于丁酸鈉誘導(dǎo)組。丁酸鈉可使DC減少IL-12、和IFN-γ/的分泌；增加IL-10的分泌。第2章丁酸鈉對未成熟樹突狀細(xì)胞的IDO、SICS-1、SOCS-2、SOCS-3表達(dá)的調(diào)控1.研究方法D

11、C的培養(yǎng)參照第1章方法：第6d時收獲未成熟DC，按1×106 cells/孔接種24孔板，每孔體積1ml，加入含rhGM-CSF和IL-4的完全培養(yǎng)液，并分組誘導(dǎo)DC分化。(1)對照組，僅用含rhGM-CSF和IL-4的完全培養(yǎng)液，不加促成熟因子LPS；(2)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)組，加入LPS 1mg/L；(3)組：丁酸鈉誘導(dǎo)組，丁酸鈉誘導(dǎo)組按照丁酸鈉濃度的不同，分為3組分別誘導(dǎo)。A組：加入丁酸鈉1.0 mmol/L：B組：加入丁酸鈉0

12、.75 mmol/L；C組：加入丁酸鈉0.5 mmol/L； (4)組：丁酸鈉、脂多糖混合誘導(dǎo)組，加入丁酸鈉1.0 mmol/L和LPS 1 mg/L同時誘導(dǎo)分化。各組在誘導(dǎo)24h和48h后分別收獲DC提取RNA，同時收集培養(yǎng)上清，-80℃保存，用于檢測IL-12(p40)、IL-10、IFN-γ含量。 2.結(jié)果 通過定量Real-Time PCR(qRT-PCR)反應(yīng)檢測各組IDOmRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示無論是成熟

13、組、對照組和丁酸鈉組，均可見IDO的表達(dá)，但是LPS組的IDO表達(dá)量明顯低于丁酸鈉組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；丁酸鈉能夠增加DC的IDOmRNA的表達(dá)，并且隨著丁酸鈉濃度的增加和培養(yǎng)時間的延長而增加。這個結(jié)果說明不同成熟狀態(tài)的DC對于刺激T細(xì)胞的增殖作用的差異可能和IDO的表達(dá)程度有關(guān)。對于imDC而言，Na-B組的IDO表達(dá)水平明顯高于對照組，說明丁酸鈉可以促進(jìn)imDC IDO的表達(dá)。通過qRT-PCR反應(yīng)檢測各組發(fā)現(xiàn)SOCS-

14、1、SOCS-2、SOCS-3 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示無論是成熟組、對照組和丁酸鈉組，均可見SOCS-1、SOCS-2、SOCS-3 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示丁酸鈉組SOCS-1 mRNA的表達(dá)明顯低于促成熟組(LPS)；結(jié)果顯示丁酸鈉組SOCS-2、SOCS-3 mRNA的表達(dá)明顯高于促成熟組(LPS)。丁酸鈉能夠顯著地促進(jìn)imDC的SOCS-2、SOCS-3 mRNA的表達(dá)；丁酸鈉能夠明顯的抑制imDC的SOCS-1 mRNA

15、的表達(dá)。 結(jié)論 1.在體外培養(yǎng)條件下，丁酸鈉可以明顯抑制PBMC來源的DC的成熟。表現(xiàn)為DC成熟表型的明顯下調(diào)，而且隨著丁酸鈉濃度的升高和誘導(dǎo)時間的延長可以使DC的成熟表型進(jìn)一步降低，但是會增加DC的凋亡率；實(shí)驗(yàn)提示以丁酸鈉濃度0.75 mmol/L和培養(yǎng)48h為最佳培養(yǎng)方法。 2.丁酸鈉可使DC減少IL-12、和IFN-γ的分泌；增加IL-10的分泌。 3.丁酸鈉誘導(dǎo)的DC可穩(wěn)定維持不成熟狀態(tài)，不能被L

16、PS促成熟因子再次激活。 4.無論DC的成熟狀態(tài)如何，均有IDO、SOCS-1、SOCS-2、SOCS-3的表達(dá)，imDC中的IDO、SOCS-2、SOCS-3 mRNA的表達(dá)量高于mDC；imDC中的SOCS-1表達(dá)量低于mDC。 5.丁酸鈉增強(qiáng)imDC表達(dá)高水平IDO，通過降解細(xì)胞微環(huán)境中的色氨酸，使細(xì)胞處于一種“色氨酸饑餓”狀態(tài)，從而發(fā)揮對T細(xì)胞增殖的抑制作用。 6.丁酸鈉顯著上調(diào)imDC表達(dá)SOCS-2、