DMD病人特異性iPS細胞系的誘導及其打靶的初步研究.pdf

1、杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)是一種致死性X連鎖隱性遺傳病，該疾病是由于DMD基因的突變造成Dystrophin蛋白的缺失或功能喪失所致，目前臨床上對該疾病尚無有效的治療手段，而基因治療的興起為DMD治療帶來了新的希望。本研究首先以逆轉錄病毒誘導DMD患者皮膚成纖維細胞(HDFs)成為DMD病人特異性ips細胞（DFiPS），然后構建新型非病毒核糖體區(qū)基因打靶載體pHr2-nl-CDysG，并對上述ips細胞進行打靶的初步實驗研究。為將Min

2、idystrophin基因定點整合至iPS細胞基因組中，篩選穩(wěn)定表達Minidystrophin蛋白的iPS細胞克隆奠定了基礎，也為采用ex vivo（間接體內）途徑進行DMD基因治療開辟一條新的思路。
　　第一部分:DMD患者皮膚成纖維細胞誘導自體多潛能干細胞
　　目的:利用皮膚成纖維細胞誘導建立DMD疾病特異型ips細胞系。
　　方法:利用逆轉錄病毒介導的轉染系統(tǒng)將四種經(jīng)典轉錄因子Oct4，Sox2，c-Myc和K

3、lf4導入DMD患者皮膚成纖維細胞，并且在誘導過程中添加小分子Vc和VPA，最終獲得DMD患者來源的iPS細胞。通過細胞形態(tài)學、堿性磷酸酶染色、干細胞表面多潛能標志物染色及細胞核型檢測對傳代后的克隆進行鑒定。
　　結果:(1)將包裝質粒和逆轉錄病毒載體通過脂質體 Lipofectamine2000共同轉染293T細胞后，獲得優(yōu)質逆轉錄病毒;(2)誘導出細胞克隆形態(tài)上與iPS細胞相似，挑取上述克隆傳代，堿性磷酸酶染色呈陽性，iPS細

4、胞表面標志免疫熒光檢測呈陽性。傳至P9代，仍然具有iPS樣克隆形態(tài)。(3)通過細胞染色體核型檢測顯示誘導后細胞沒有發(fā)生染色體水平的突變。
　　結論:利用逆轉錄病毒系統(tǒng)將DMD患者皮膚成纖維細胞重編程為iPS細胞，通過細胞核型、表面標志物及體外分化等鑒定DMD疾病特異型iPS細胞系的全能性。
　　第二部分:新型DMD基因治療載體的構建及打靶探究
　　目的:構建攜帶Minidystrophin治療基因的新型非病毒核糖體基因

5、區(qū)打靶載體，通過打靶將Minidystrophin基因定點整合至DFiPS細胞基因組中，篩選穩(wěn)定表達Minidystrophin蛋白的DFiPS細胞克隆。
　　方法:(1) pHr2-nl-CDysG打靶載體的構建:首先用PCR克隆CAG啟動子和BGH PolyA，然后將其正向連入pGEM-T Easy載體當中。從本室構建的核糖體基因區(qū)打靶載體pHrneoDysG中酶切下DysG融合基因，連入CAG啟動子和BGH PolyA之間。

6、再將CAG-DysG-BGH片段從pGEM-T Easy載體上切下，連入本室構建的新型核糖體基因區(qū)打靶載體pHr2-nl中，得到DMD基因治療載體pHr2-nl-CDysG。(2)采用核轉染的方法轉染單細胞化的DFiPS細胞，并在轉染后加入Y27632提高細胞存活率。
　　結果:(1)構建的載體pHr2-nl-CDysG經(jīng)PmeⅠ和AhdⅠ酶切鑒定，所獲得的酶切片段大小與理論值相符。(2)載體pHr2-nl-CDysG的測序結果與