凋亡抑制基因survivin特異性shRNA誘導(dǎo)喉癌細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、背景：Survivin基因是近年來發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因，它是凋亡抑制蛋白因子(inhibitor 9f apoptosis proteins，IAPs)家族的成員之一。Surivin是迄今已鑒定的8個IAPs家族成員(XIAP，HIAP-1，HIAP-2，NAIP,ILP-2，ML-IAP/Livin，apollon，survivin)中分子量(16.5 kD)最小和最具有基礎(chǔ)與臨床意義的基因，因而成為當前腫瘤領(lǐng)域中最為矚目的一個研究熱點

2、之一。Survivin的過量表達可以幫助腫瘤細胞逃避細胞周期檢測點，使腫瘤細胞逃避凋亡，實現(xiàn)異常增殖。抑制凋亡、促進細胞增殖和參與細胞周期調(diào)控這三種重要的功能密切相關(guān)，共同作用于細胞，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。大多數(shù)研究表明survivin只表達于腫瘤組織，而在正常組織中不表達，雖有少數(shù)學(xué)者認為survivin也可表達于正常組織，但這些研究也表明其在正常組織的表達強度顯著低于其在腫瘤組織的表達強度，這一獨特的特性，使survivin當仁不讓

3、的成為新的腫瘤研究和治療的靶點。RNA干擾是用與目的基因mRNA相同序列的21-23 nt雙鏈小分子干擾RNA來特異性高效率的抑制目的基因蛋白的表達。有研究表明，帶有shRNA(小發(fā)夾RNA)表達框架的載體可以取得較高的RNA干擾效應(yīng)，已有不少學(xué)者應(yīng)用survivin特異的shRNA或siRNA對多種腫瘤進行了干預(yù)治療，取得了顯著的效果，但對喉腫瘤的治療國內(nèi)外尚未見報道。 本實驗的目的： 1.對60例喉鱗癌病理切片和10

4、例正常喉部粘膜進行免疫組織化學(xué)檢測，觀察survivin在喉鱗癌組織和正常喉部粘膜的表達情況； 2.構(gòu)建表達shRNA質(zhì)粒載體，通過轉(zhuǎn)染細胞(喉癌細胞株)進行體外RNA干擾實驗，觀察其對喉癌細胞中survivin基因的抑制效果，以及抑制喉癌細胞的生長和誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。 方法： 1.采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測survivin基因在60例喉鱗狀細胞癌標本、10例正常喉粘膜中的表達。 2.選取了 surviv

5、in基因(NM_001168)序列中的三個位點序列作為siRNA 的正義鏈，正義鏈和反義鏈之間加入 9 個寡核苷酸(TTCAAGACG)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以TTTTTT作為終止信號，5’-端為BamH Ⅰ酶切位點末端，3’-端為HindⅢ酶切位點末端，合成寡核苷酸序列克隆到載體上，構(gòu)建三個靶向survivin的質(zhì)粒載體分別命名為survivin-shRNA-1， survivin-shRNA-2， survivin-shRNA-3，通過序列

6、測定鑒定重組子的正確性。 3.將三個重組survivin-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，48小時后收集細胞進行檢測，運用反轉(zhuǎn)錄PCR檢測在mRNA水平survivin-shRNA質(zhì)粒對survivin基因的沉默效果；運用Western Blot檢測在蛋白水平survivin-shRNA質(zhì)粒對survivin基因的沉默效果；連續(xù)觀察五天喉癌細胞的生長狀況，構(gòu)建生長曲線，觀察對喉癌細胞的生長抑制作用；應(yīng)用PI單染流式細胞儀檢測細胞周期，觀

7、察干擾質(zhì)粒對細胞周期的影響；應(yīng)用流式細胞儀通過Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞的早期凋亡，PI單染檢測細胞的晚期凋亡，觀察干擾質(zhì)粒對喉鱗癌細胞的凋亡誘導(dǎo)作用。 結(jié)果： 1.Survivin蛋白在10例正常喉粘膜中均無表達，60例喉鱗癌標本中有41例陽性，陽性表達率為68.33％：其中男性56例，陽性例數(shù)為40例，陽性表達率為71.4 3％，女性4例，陽性例數(shù)為1例，陽性表達率為25％：60歲以上者32例，陽

8、性例數(shù)為22例，陽性表達率為68.75％，60歲以下者(包括60歲)28例，陽性例數(shù)為19例，陽性表達率為67.86％；聲門上型18例，陽性例數(shù)為13例，陽性表達率為72.22％，聲門型42例中28例陽性，陽性表達率為66.67％；按照國際抗癌協(xié)會(UICC)TNM分類標準(1992)第四版第二次修訂的方案，臨床分期：Ⅰ-Ⅱ期31例，陽性例數(shù)為17例，陽性表達率54.84％，Ⅲ-Ⅳ期29例，陽性例數(shù)24例，陽性表達率82.76％：病理分

9、級：高分化鱗狀細胞癌28例，陽性例數(shù)為20例，陽性表達率為71.43％，中分化鱗狀細胞癌19例，陽性例數(shù)為12例，陽性表達率為63.16％，低分化鱗狀細胞癌13例，陽性例數(shù)為9例，陽性表達率為69.23％：病理證實頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例，陽性例數(shù)為14例，陽性表達率為93.33％，無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例，陽性例數(shù)為27例，陽性表達率為60％。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，喉癌組survivin蛋白的表達率明顯高于正常對照組(p<0.001)，survivi

10、n蛋白表達與喉鱗癌患者臨床分期、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有顯著性(P<0.05)，頸淋巴結(jié)陽性者survivin蛋白陽性表達率高于頸淋巴結(jié)陰性者；Ⅲ-Ⅳ期的患者survivin蛋白陽性表達率高于Ⅰ-Ⅱ期的患者：survivin蛋白陽性表達在不同性別組的差異無顯著性(P=0.056)；survivin蛋白陽性表達在不同年齡組的差異無顯著性(P=0.941)；survivin蛋白陽性表達在不同發(fā)生部位的差異無顯著性(P=0.674)；sur

11、vivin蛋白陽性表達在不同病理分級組的差異無顯著性(P=0.836)。 2.酶切鑒定和DNA序列測定結(jié)果證實三個重組質(zhì)粒載體survivin-shRNA構(gòu)建正確，插入序列位置正確。 3.重組質(zhì)粒survivin-shRNA轉(zhuǎn)染細胞后， RT-PCR結(jié)果顯示三個survivin-shRNA質(zhì)粒均使survivin基因在mRNA水平受到了顯著的抑制，分別下降了65.7 7±0.82％，56.66±0.70％，63.26±1

12、.0％，與轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒組相比具有顯著性差異，三者之間相比survivin-shRNA-1和survivin-shRNA-3無顯著性差異，survivin-shRN A-2抑制率低于前兩者，而轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒組的mRNA量與未處理組相仿，無明顯下調(diào)；Western-blot結(jié)果顯示三個survivin-shRNA質(zhì)粒均使survivin基因在蛋白水平受到了顯著的抑制，分別下降了61.5 0±0.79％，52.91±1.43％，59.3

13、6±0.53％，與轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒組相比具有顯著性差異，三者之間相比survivin-shRNA-1和survivin-shRNA-3無顯著性差異， survivin-shRNA-2抑制率低于前兩者，而轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒組的蛋白表達量與未處理組相仿，無明顯下調(diào)；生長曲線結(jié)果顯示三個survivin-shRN A質(zhì)粒均使喉癌細胞株生長受到顯著抑制，在轉(zhuǎn)染后72小時抑制效果達到最高，與轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒組相比具有顯著性差異，三者之間相比，sur

14、vivin-shRNA-1和survivin-shRNA-3抑制率相仿，且自72小時后survivin-shRN A-2組的細胞數(shù)與其他兩組有顯著性差異，說明survivin-shRNA-2的抑制效果較survivin-shRNA-1，3為弱。PI單染流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒細胞組出現(xiàn)明顯G2/M期的阻滯，并且出現(xiàn)明顯的亞G1峰，標示細胞晚期凋亡，凋亡百分率分別為15.32±1.969％，8.58±0.949％，14.

15、85±1.786％，與轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒組相比具有顯著性差異，三者之間相比survivin-shRNA-1和survivin-shRNA-3無顯著性差異，survivin-shRN A-2凋亡率低于前兩者，而轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒組未出現(xiàn)G2/M期的阻滯現(xiàn)象，并且凋亡率(3.22±1.06％)與未處理組(1.36±0.243％)無明顯差別；Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞早期凋亡，顯示凋亡率分別為13.63±1.940％，8.61

16、±1.400％， 12.71±2.141％，與轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒組相比具有顯著性差異，三者之間相比survivin-shRNA-1和survivin-shRNA-3無顯著性差異， survivin-shRNA-2凋亡率低于前兩者，而轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒組的早期凋亡率為2.58±0.632％，與未處理組相比(早期凋亡率為2.43±0.663％)無明顯差別。 結(jié)論及意義：重組survivin-shRNA質(zhì)?？梢韵抡{(diào)喉癌細胞株中surviv