EBV陽性胃癌細(xì)胞系的建立及其特異性治療體外實(shí)驗(yàn)的初步探討.pdf

1、本文研究目的：通過在體外建立EBV陽性胃癌細(xì)胞系，探索是否5-azacytidine可以使Cp去甲基化進(jìn)一步探索用siRNA抑制DNA甲基化酶的表達(dá)使EBV Cp激活而對EBV相關(guān)胃癌的治療有所幫助。 研究材料和方法： 一、細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS細(xì)胞，生長于10％的胎牛血清和10U/ml青霉素的Ham F-12培養(yǎng)液中，NUGC3細(xì)胞生長于10％的胎牛血清和10U/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5％

2、CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。EBV陽性．AGS/xneo細(xì)胞克隆和NUGC3/EBV生長于10％的胎牛血清和10U/ml青霉素，G418 500ug/ml的Ham F-12或DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。Akata/xneo是EBV陽性Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系<'[18]>，生長于10％的胎牛血清和10U/ml青霉素，G418 700ug/ml的RPMI1640培養(yǎng)液中。P3HR1，MutuⅢ

3、，Daudi均生長于10％的胎牛血清和10U/ml青霉素的RPMll640培養(yǎng)液中。 二、EBV陽性胃癌細(xì)胞系的建立 采用cell to cell感染法。將用0.5％anti-human IgG誘導(dǎo)裂解感染的Akata細(xì)胞加入24小時(shí)前傳代的胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS或NUGC3的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)2-3天。反復(fù)清洗去除殘存的Akata細(xì)胞。1000細(xì)胞/孔鋪至96孔板，G418 500ug/ml選擇篩選EBV陽性克隆。

4、三、免疫熒光染色法檢測 一定濃度的細(xì)胞抹片后晾干。檢測EBV EBNA時(shí)用丙酮：甲醇=1∶1混合液-20℃固定3分鐘。一抗用人血清37℃反應(yīng)40分鐘，PBS洗片5分，風(fēng)干后，二抗用FITC標(biāo)識的抗人C3C補(bǔ)體37％反應(yīng)20分鐘，PBS洗片10分鐘，風(fēng)干后熒光顯微鏡下觀察。 四、蛋白檢測 western blot按常規(guī)方法操作，樣品為全細(xì)胞超聲裂解產(chǎn)物，4×10<'5>細(xì)胞裂解液上樣8％分離膠SDS-PAGE蛋白電

5、泳，電轉(zhuǎn)硝酸纖維膜(PVDF)膜，行Western blot，即轉(zhuǎn)膜成功后5％脫脂奶粉封閉，TBST洗膜后，加人血清一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜；加鼠抗人1∶2000 HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育30分，TBST洗膜，混合化學(xué)發(fā)光試劑1和試劑2加至膜上lmin，最后X片顯影。相應(yīng)抗體見附錄2。 五、RNA檢測 RT-PCR及PCR Southern：細(xì)胞總RNA的提取按Trizol一步法RNA提取試劑盒說明進(jìn)行RNA的提

6、?。?-10×10<'6>細(xì)胞加入Trizol試劑1mL勻漿后置室溫5min，加入氯仿0.2mL，于4℃12000×g離心15min(離心后，混合物分成三部分-底層的酚-氯仿相、中間相和上層的元色水相。RNA在水相，DNA和蛋白質(zhì)在有機(jī)相及中間相)，取上清，加異丙醇0.5mL15min后于4℃ 12000 × g離心15min，取沉淀溶于無RNA酶的去離子水中，用于RT-PCR擴(kuò)增。抽提出的RNA經(jīng)凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)

7、260nm和280nm鑒定RNA的純度。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)及電泳、結(jié)果判定。反應(yīng)體系為：RNA 2ug 6mer random primer 1ul用無RNAse水加至終體積5ul90℃ 10min立即放于冰上。5×緩沖液4μL，(10mM each)dNTP混合物1μL，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，25mmol MgSO<,4>5μL，用無RNAse水加至終體積20μL。37℃反轉(zhuǎn)錄60min。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，P

8、CR反應(yīng)體系為50μL，包括10×buffer 5μL，MgCl<,2> 1.5 mmol/L，dNTP 0.1 mmoL/L，上下游引物各0.5μmmol/L，Taq DNA聚合酶1.OU，cD-NA模板1 μL。參數(shù)設(shè)置如下94℃變性1 min，50℃退火45秒，72℃延伸1min，進(jìn)行30個(gè)周期的循環(huán)反應(yīng)，最后72℃延伸5min。2％瓊脂糖凝膠(溴化乙錠染色)電泳100V 30min，紫外燈下觀察記錄照相。PCR-Southern

9、：用堿變性法將電泳結(jié)果轉(zhuǎn)印至Hybond-N+尼龍膜(amersham pharmacia bio-tec，IRELAND)。用Gene Images 3-oligolabelling Module Kit(Amersham Bio-science RPN5770)標(biāo)記探針，嚴(yán)格按照說明進(jìn)行雜交，洗膜，最后用化學(xué)發(fā)光檢測雜交信號。引物序列見附錄1。 六、質(zhì)粒的構(gòu)建與細(xì)胞轉(zhuǎn)染 合成每條編碼shRNA的DNA模板的兩條單鏈，

10、退火DNA單鏈得到shRNA的DNA雙鏈模板。模板鏈后面接有RNA PolyⅢ聚合酶轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)，同時(shí)兩端分別設(shè)計(jì)BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，可以克隆到siRNA載體多克隆位點(diǎn)的BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)之間。PSilencer 2.1 hyg(AmbionInc)空載體用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，1％瓊脂糖凝膠電泳，回收線性載體。把退火的DNA模板雙鏈連接到線性載體中。采用T4連接酶，插入片斷與載體的摩爾比約為3∶1。連

11、接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，在LB Amp培養(yǎng)基上涂板，37℃培養(yǎng)過夜。挑取轉(zhuǎn)化的菌落再進(jìn)行測序鑒定，確定shR-NA編碼框架和模板序列正確無誤。再將U6啟動(dòng)子和shRNA的DNA雙鏈模板片斷連接到Orip-SV-hyg載體上。ShRNA序列見附錄1。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：嚴(yán)格按照Lipofectamine<'TM> Reagent(Invitrogen 18324)說明進(jìn)行操作。細(xì)胞接種到35 mm培養(yǎng)皿中，加入含10％胎牛血清的DME

12、M培養(yǎng)液中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。待細(xì)胞貼壁生長達(dá)70％融合時(shí)，棄去培養(yǎng)液，無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次，滴加含Lipofectamin(20μL)和質(zhì)粒DNA(2μg)的無血清培養(yǎng)基0.8 mL，輕輕混勻，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換普通培養(yǎng)液含150 mg/L的hygromycin培養(yǎng)液篩選。48小時(shí)后檢測。 研究結(jié)果： 一、建立的EBV陽性胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS/EBV和NUGC

13、3/EBV體外培養(yǎng)呈Ⅰ型潛伏感染：體外感染后篩選的細(xì)胞克隆為EBV陽性，EBNA免疫熒光染色見圖1。EBV相關(guān)蛋白的免疫印記(見圖2)顯示核蛋白除EBNA1陽性外EBNA2 EBNA3s均為陰性。膜蛋白LMP1也為陰性。RT-PCR檢測不被翻譯成蛋白的小RNA(EBERs)為陽性(見圖3)。而EBV體外轉(zhuǎn)化的LCL則均為陽性，表現(xiàn)Ⅲ型隱形感染。在此作為陽性對照，而EBV陰性細(xì)胞作為陰性對照。 二、5-azacycidine可以活

14、化AGS/EBV和NUGC3/EBV內(nèi)EBNA Cp(C啟動(dòng)子)并呈計(jì)量依存性。RT-PCR法檢測AGS/xneo和NUGC3/EBV中EBV EBNA啟動(dòng)子顯示Cp Wp均呈不活化狀態(tài)，Qp為活化狀態(tài)(見圖4)。以相應(yīng)濃度5-azacycidine處理5天后用RT-PCR及PCR-southern檢測啟動(dòng)子，結(jié)果顯示Cp呈計(jì)量依賴性活化(見圖5，6)。Wp Qp無明顯變化(見圖7)。 三、5-azacycidine處理后伴隨著

15、Cp活化，可見LMP1呈計(jì)量依賴性表達(dá)(見圖8)。 四、5-azacycidine處理后用western blot檢測DNA甲基化酶，結(jié)果顯示DNA甲基化酶1(DNMT1)被明顯抑制(見圖9)。 五、用RT-PCR檢測EBV潛伏感染Ⅰ型和Ⅲ型Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系DNA甲基化酶的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示Ⅰ型細(xì)胞中DNA甲基化酶1(DNMT1)和DNA甲基化酶3b(DNMT3b)的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于Ⅲ型潛伏感染細(xì)胞(見圖10)

16、。 六、用干涉RNA(siRNA)抑制DNA甲基化酶1(DNMT1)不能活化Cp。用Lipofectamin和DNMT1 shRNA的DNA雙鏈模板片斷Orip-EBNA1載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可見DNMT1的表達(dá)被明顯抑制。Western blot檢測DNMT1結(jié)果見圖11。但Cp無明顯活化。RT-PCR結(jié)果見圖12。 七、干涉RNA(siRNA)抑制DNA甲基化酶1(DNMT1)和抑制DNA甲基化酶3b(DNMT3b)不能明

17、顯活化Cp。 采用干涉RNA(siRNA)抑制DNA甲基化酶1和3b(DNMT3b)不能明顯活化Cp。用Lipofectamin和DNMT1 shRNA的DNA雙鏈模板片斷Orip-EBNA1載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可見DNMT3b的表達(dá)被抑制。而DNMT1表達(dá)則增強(qiáng)。相反也可見在DNMT1被抑制時(shí)DNMT3b有所增強(qiáng)。Western blot檢測DNMT1及3b結(jié)果見圖13。用RNA干涉法同時(shí)抑制DNMTl和3b時(shí)Cp有少許活化。RT-