臨床分離黏質(zhì)沙雷菌染色體及質(zhì)粒介導的喹諾酮類耐藥基因的檢測及其與β-內(nèi)酰胺酶和16S rRNA甲基化酶基因的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　了解安徽地區(qū)2005~2010年臨床分離的104株黏質(zhì)沙雷菌耐藥情況和染色體及質(zhì)粒介導的喹諾酮類耐藥基因的種類、分布,為臨床合理選擇抗菌藥物提供依據(jù)。
　　研究臨床分離黏質(zhì)沙雷菌染色體及質(zhì)粒介導的喹諾酮類耐藥基因與β-內(nèi)酰胺酶和16SrRNA甲基化酶基因的相關(guān)性。
　　材料與方法：
　　菌株來源：
　　104株黏質(zhì)沙雷菌臨床分離株來自安徽省細菌耐藥監(jiān)測中心2005年~2010年每年9月份收集的監(jiān)

2、測網(wǎng)所屬34所醫(yī)院(由皖南、皖中、皖北不同級別的醫(yī)院組成)住院和門診患者的各類臨床標本。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922,轉(zhuǎn)移接合試驗受體菌大腸埃希菌J53AZR為安徽省細菌耐藥監(jiān)控中心保存。
　　方法：
　　1.采用瓊脂倍比稀釋法進行抗菌藥物敏感性試驗,藥物敏感性試驗質(zhì)控菌采用E.coliATCC25922。
　　2.用煮沸法提取細菌總DNA,堿裂解法提取質(zhì)粒;用聚合酶鏈反應(PCR)方法擴增染色體gyrA與pa

3、rC基因和質(zhì)粒介導喹諾酮耐藥(PMQR)基因;PCR產(chǎn)物純化測序,結(jié)果與Genbank中基因序列進行比對,以明確gyrA與parC基因是否突變以及質(zhì)粒介導喹諾酮類耐藥基因的基因型。
　　3.用PMQR基因陽性菌株與大腸埃希菌J53AzR行轉(zhuǎn)移接合試驗;采用瓊脂倍比稀釋法對受體菌與接合子進行最低抑菌濃度(MIC)測定。
　　4.臨床分離菌株的總DNA為模板,PCR方法擴增β-內(nèi)酰胺酶和16SrRNA甲基化酶基因;對PCR產(chǎn)物進

4、行測序,結(jié)果與Genbank中基因序列進行比對,以明確基因型。然后用接合子的質(zhì)粒DNA為模板,PCR擴增β-內(nèi)酰胺酶和16SrRNA甲基化酶基因,驗證這些耐藥基因是否同時發(fā)生轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)果：
　　1.粘質(zhì)沙雷菌在呼吸道痰標本中檢出率最高,達59.6％;主要分布于呼吸內(nèi)科、重癥監(jiān)護病房、老年病科等;藥敏結(jié)果顯示,粘質(zhì)沙雷菌對1、2代頭孢菌素表現(xiàn)出很高的耐藥性,耐藥率在79.8%-91.3%以上;對左氧氟沙星、加替沙星,4代頭

5、孢菌素比較敏感,敏感率在70%以上;未發(fā)現(xiàn)對亞胺培南、美羅培南耐藥菌株;頭孢西丁耐藥株對大多數(shù)抗菌藥物的耐藥率均較高,且與非耐藥株的藥敏結(jié)果進行比較兩者之間耐藥性差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　2.104株黏質(zhì)沙雷菌中檢出6株攜帶qnr基因和(或)aac(6￠)-Ib-cr基因,其中3株攜帶qnr基因;4株攜帶aac(6￠)-Ib-cr基因(其中1株同時攜帶qnr基因);未檢測出qnrA、qnrC、qnrD及qepA基因

6、。9株檢測出gyrA基因突變,7株檢測出parC基因突變。qnr基因:qnr基因陽性菌株經(jīng)測序并與GenBank上的基因序列進行比對,確定2株qnrB基因陽性菌均為qnrB6亞型,1株qnrS基因陽性菌株為qnrS2亞型。qnrB6與qnrS2的GenBank注冊號分別為JQ034317和JQ041635。aac(6￠)-Ib-cr基因:4株經(jīng)PCR產(chǎn)物電泳檢測出現(xiàn)300bp左右的目的條帶,為aac(6￠)-Ib基因陽性菌株,PCR產(chǎn)物

7、經(jīng)測序確定為aac(6￠)-Ib-cr,GenBank注冊號為JQ034318。gyrA與parC基因突變:9株gyrA陽性的菌株均有第83位氨基酸密碼子突變,由TCG變?yōu)門TG,從而導致編碼的氨基酸由Ser變?yōu)長eu,或同時有第87位氨基酸密碼子由GAC變?yōu)锳AC,從而導致編碼的氨基酸由Asp變?yōu)锳sn;7株parC陽性的菌株均有第80位氨基酸密碼子突變,由AGC變?yōu)锳TT,從而導致編碼的氨基酸由Ser變?yōu)镮le,其中3株同時存在第5

8、7、129、131與134位氨基酸密碼子突變。gyrA的GenBank注冊號為JQ034320和JQ235843;parC的GenBank注冊號為JQ034319和JQ235844。
　　3.6株攜帶qnr基因和(或)aac(6￠)-Ib-cr基因的菌株中有5株轉(zhuǎn)移接合成功,接合子經(jīng)生化鑒定為大腸埃希菌。經(jīng)PCR擴增及DNA測序分析證實,2株接合子(T22、T91)攜帶qnrB6基因;1株接合子(T64)攜帶qnrS2基因;3株接

9、合子(T60、T86、T91)攜帶aac(6￠)-Ib-cr基因。藥敏結(jié)果表明,這5株接合子與受體菌相比,對環(huán)丙沙星的耐藥率至少提高了8～32倍。
　　4.11株gyrA,parC突變株與qnr,aac(6￠)-Ib-cr陽性株中,分別檢測到SHV型3株,CTX-M型2株,OXA型4株和TEM型2株。測序結(jié)果經(jīng)BLAST系統(tǒng)比對,分別為:blaSHV-5,blaCTX-M-14,blaOXA-1,blaTEM-1。檢測到16SrR

10、NA甲基化酶基因陽性株2株,其測序結(jié)果經(jīng)BLAST系統(tǒng)比對均為armA型。β-內(nèi)酰胺酶基因和16SrRNA甲基化酶基因可以聯(lián)合PMQR基因同時發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論：
　　1.安徽地區(qū)黏質(zhì)沙雷菌對多種抗菌藥物耐藥,且多重耐藥現(xiàn)象嚴重,應加強細菌耐藥監(jiān)測。
　　2.證實了在安徽地區(qū)存在質(zhì)粒介導的喹諾酮類耐藥的黏質(zhì)沙雷菌,也是國內(nèi)第一次在黏質(zhì)沙雷菌中檢出qnr基因。
　　3.陽性菌株接合子對喹諾酮類抗菌藥物的MIC