臨床分離多重耐藥不動桿菌β-內(nèi)酰胺酶、整合子及新基因的研究.pdf

1、目的：
　　 了解安徽省多重耐藥不動桿菌β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因，揭示其相關(guān)耐藥機(jī)制，指導(dǎo)臨床合理用藥。
　　 了解安徽省多重耐藥不動桿菌整合子基因及其相關(guān)耐藥基因。
　　 了解新型質(zhì)粒介導(dǎo)OXA-146 型酶的分子生物學(xué)特性。
　　 材料與方法：
　　 安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)控中心收集2007年9月份35所醫(yī)院,住院和門診患者的各種臨床送檢標(biāo)本，無重復(fù)分離的不動桿菌176 株。采用MH 瓊脂倍比稀釋法對野

2、生菌進(jìn)行14 種抗菌藥物的藥物敏感試驗。
　　 對多重耐藥菌株用煮沸法提取細(xì)菌DNA，對碳青霉烯酶和超廣譜酶特異片段，Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ型整合酶基因擴(kuò)增并對I 型整合酶基因陽性菌株進(jìn)行I 型整合子結(jié)構(gòu)基因擴(kuò)增，以揭示其是否存在多種耐藥機(jī)制。
　　 將PCR 陽性的菌株行轉(zhuǎn)移接合試驗，并行全編碼引物PCR 擴(kuò)增。對多次測序并經(jīng)GenBank 比對后確定的產(chǎn)新酶菌株進(jìn)行以下實驗：PCR 擴(kuò)增野生株和/或轉(zhuǎn)移接合子中的OXA-146

3、型碳青霉烯酶編碼基因片段，克隆入pUC-118 載體，表達(dá)于感受態(tài)細(xì)胞大腸埃希菌JM109 中，再次測定核苷酸序列，結(jié)果至GenBank 比對，進(jìn)行DNA 序列分析。
　　 將新酶全編碼基因克隆入表達(dá)載體pET28a，轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細(xì)胞E.coli JM109，用加有抗菌素的瓊脂平板進(jìn)行轉(zhuǎn)化株篩選。用瓊脂平皿稀釋法對野生株、接合子與轉(zhuǎn)化株同時進(jìn)行MIC測定。
　　 采用超聲破碎法進(jìn)行產(chǎn)新酶細(xì)菌轉(zhuǎn)化株的粗酶提取，等電聚焦電泳

4、測定其pI。
　　 對粗酶純化后，SDS-PAGE和考馬斯藍(lán)染色測定新酶分子量大小，進(jìn)行酶促反應(yīng)動力學(xué)研究，以初步了解新酶的動力學(xué)特性。
　　 采用Southern Blotting 試驗再次驗證新酶是否由質(zhì)粒介導(dǎo)并定位其編碼基因所在質(zhì)粒大小。
　　 結(jié)果：
　　 176 株不動桿菌中有34 株對包括碳青霉烯類抗菌素在內(nèi)的多種抗菌藥物耐藥，其中鮑曼不動桿菌16 株，鮑曼/溶血不動桿菌15株，醋酸鈣不動桿菌

5、2 株，洛菲不動桿菌1 株。34 株對碳青霉烯類抗菌素耐藥的菌株同時也對哌拉西林、哌拉西林/三唑巴坦、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢呋辛、氨曲南、慶大霉素、環(huán)丙沙星耐藥。
　　 34 株多重耐藥不動桿菌中19 株OXA-23 陽性，24 株TEM-1 陽性，10 株CTX-M-1陽性，10 株CTX-M-9 陽性，23 株Ⅰ類整合酶陽性。同時含OXA-23 型酶和Ⅰ類整合酶共17 株。23 株Ⅰ類整合酶陽性菌株有21 株測出

6、I類整合子基因結(jié)構(gòu)，未檢測到OXA-24 型酶,IMP、VIM、SIM 型金屬酶基。19 株blaOXA-23陽性產(chǎn)物克隆后做DNA測序進(jìn)行BLASTn 比對,17 株與基因庫中同名基因序列完全一致，另外2 株有突變。
　　 突變株鮑曼不動桿菌AB1622和醋酸鈣不動桿菌AC518 與基因庫中OXA-23 型酶比較在同時在第832和833 位點核苷酸之間插入了3個堿基（GGC），在221 核苷酸位點引起一個丙氨酸插入突變，該序列

7、已在GenBank 登錄（分別為FJ194460;
　　 FJ194494）并被Jacoby，George A 命名為OXA-146 型酶。
　　 本研究發(fā)現(xiàn)野生株AC518 同時含有TEM-1 型酶、CTX-M-1 型酶和Ⅰ類整合子，野生株AB1622 含有TEM-1 型酶和Ⅰ類整合子。AC518和AB1622Ⅰ類整合子結(jié)構(gòu)基因顯示均含有arr3、aacA4，不含有OXA-146 型酶、TEM-1 型酶、CTX-M-1

8、 型酶。其它I類整合子結(jié)構(gòu)基因中含有aacA4、eatB8、aadA1、art3等常見的構(gòu)成整合子耐藥基因盒的基因，解釋了本研究中不動桿菌對氨基糖苷類抗菌藥、利福平、氯霉素耐藥的原因。
　　 產(chǎn)OXA-146 型酶菌株的轉(zhuǎn)移接合試驗和克隆表達(dá)試驗均取得成功，其野生株、接合子及轉(zhuǎn)化株的MIC 結(jié)果顯示：野生株和接合子有著幾乎相同的耐藥譜，而轉(zhuǎn)化株對部分藥物的敏感性較前兩者明顯下降。
　　 產(chǎn)OXA-146 型酶細(xì)菌轉(zhuǎn)化株的

9、等電聚焦及SDS-PAGE 結(jié)果表明，其等電點在7.7左右。Southern Blotting 試驗再次證實了新酶由質(zhì)粒介導(dǎo)并定位其編碼基因位于52Kb的質(zhì)粒。
　　 結(jié)論：
　　 本研究顯示安徽省多重耐藥不動桿對β-內(nèi)酰胺類抗菌素、碳青霉烯類抗菌素、氨基糖苷類抗菌素耐藥主要和產(chǎn)OXA-23 型碳青霉烯酶，TEM-1 型、CTX-M-1型及CTX-M-9 型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶及I類整合子中含有的相關(guān)氨基糖苷類耐藥基因有關(guān)