雞大腸桿菌16S rRNA甲基化酶的質(zhì)粒定位及rmtB基因的遺傳背景.pdf

1、本研究采用PCR方法調(diào)查了16S rRNA甲基化酶基因(armA,rmtA,rmtB,rmtC,rmtD和npmA)在2008年河南省鄭州周邊收集分離的120株雞大腸桿菌中的分布。并同時(shí)檢測(cè)了16S rRNA甲基化酶陽(yáng)性菌株攜帶ESBLs基因(TEM,SHV,CTX-M)的情況。
　　 在此基礎(chǔ)上,為了進(jìn)一步了解16S rRNA甲基化酶的傳播方式及機(jī)制,首先對(duì)16S rRNA甲基化酶陽(yáng)性菌株進(jìn)行質(zhì)粒抽提,對(duì)原始菌株的質(zhì)粒采用So

2、uthern雜交證實(shí)16S rRNA甲基化酶基因rmtB是否位于質(zhì)粒上。接著,以DH10B為受體菌,進(jìn)行了質(zhì)粒的電穿孔轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。
　　 提取轉(zhuǎn)化陽(yáng)性菌株質(zhì)粒,分別對(duì)原始菌株和轉(zhuǎn)化菌株的質(zhì)粒進(jìn)行MegaBase瓊脂糖凝膠電泳分析,比較其耐藥質(zhì)粒圖譜差異；并采用Southern雜交證實(shí)16S rRNA甲基化酶基因rmtB是否轉(zhuǎn)化成功；通過(guò)對(duì)rmtB基因陽(yáng)性菌株質(zhì)粒進(jìn)行酶切,用Southern雜交證實(shí)rmtB基因位于相同或者不同的質(zhì)粒

3、上,接著將酶切片段與pBC SK+載體連接并轉(zhuǎn)化、插入片段確認(rèn)成功后,送基因測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序,并進(jìn)行序列比對(duì),以進(jìn)一步了解rmtB的分子遺傳背景。
　　 結(jié)果表明,在分離的120株大腸桿菌中,僅檢測(cè)到16SrRNA甲基化酶基因armA和rmtB基因,其檢出率分別為2.5％(3/120)和7.5％(9/120)。12株16S rRNA甲基化酶陽(yáng)性菌株均攜帶TEM-1。其中分別有l(wèi)株還攜帶有blaCTX-M-14及blaCTX-M-

4、65。
　　 轉(zhuǎn)化試驗(yàn)和質(zhì)粒圖譜比較分析結(jié)果表明,攜帶rmtB基因的陽(yáng)性質(zhì)粒可傳遞給受體菌E.coliDH10B。Southern雜交證實(shí)rmtB基因位于質(zhì)粒上。成功地獲得了2株分別為4.6k和7.0k的rmtB基因的分子遺傳圖譜。測(cè)序結(jié)果表明,4.6k的圖譜中,rmtB基因的下游存在著ISCR1插入序列；而7.0k的圖譜中,rmtB基因的下游存在著IS26插入序列和Tn1721轉(zhuǎn)座酶基因。
　　 綜上所述,16S rR