銅綠假單胞菌對β-內酰胺類及喹諾酮類藥物的耐藥性及耐藥基因的研究.pdf

1、目的 了解本地區(qū)臨床分離的銅綠假單胞菌對β-內酰胺類和喹諾酮類藥物的耐藥情況，為臨床合理用藥提供參考依據(jù)；對多重耐藥銅綠假單胞菌進行基因分型，了解其同源性；重點研究銅綠假單胞菌產β-內酰胺酶的特性和對喹諾酮類藥物的耐藥機制。 方法 l、用瓊脂稀釋法檢測β-內酰胺類和喹諾酮類藥物對70株銅綠假單胞菌臨床分離株的MIC，并檢測泵抑制劑CCCP對MIC的影響；用Nitrocefin顯色法對銅綠假單胞菌產β-內酰胺酶進行

2、定性檢測；改良三維試驗檢測AmpC酶和ESBLs；對多重耐藥株選用ERIC2為引物，進行PCR分型，確定其同源性。 2、用特異性引物對質粒和染色體DNA進行PCR擴增，以確定產酶基因的位置及類型；IEF電泳檢測細菌所產TEMβ-內酰胺酶的pI；對TEM基因進行DNA序列測定和同源性分析，并對其進行原核表達。 3、從臨床銅綠假單胞菌中篩選出CIP耐藥菌10珠和敏感菌10珠，分別對兩組進行CIP攝取實驗，并對II類拓撲異構酶

3、gyrA和parc基因的QRDR進行PCR擴增，用限制性內切酶SacII對保守區(qū)進行酶切，并用PCR-SSCP技術篩查其基因突變，最后用序列分析明確突變基因。 結果 1、70株銅綠假單胞菌對PIP的耐藥率最高為35．7％，最低為IMt的7．1％，對AMK也較低，為11．4％，對其他11種抗菌藥物的耐藥率在17．1％～32．9％之間。外排泵陽性株為4株；所試菌40株產β-內酰胺酶，其中6株菌高產AmpC酶，2株產ESBLs

4、；ERIC2引物可將2C株多重耐藥銅綠假單胞菌分成個7基因型。 2、僅8株銅綠假單胞菌分離出一個約7kb的質粒，PCR擴增4株TEM基因陽性，DNA序列測定分析2株產廣譜酶TEM-1，另2株產TEM型ESBLs(SHV-29和SHV-147)，其中blaSHV．147與blaSHV-29基因高度同源，其所推導的氨基酸序列與blaSHV．29相比較僅有1個氨基酸殘基的差異(Ala222→Val)，為一種新的質粒介導SHV型β-內酰

5、胺酶(GenBank登錄號：DQ279850)；染色體DNA的PCR結果顯示6株菌ampC基因呈陽性；重組表達的TEM-147β-內酰胺酶pI約為5．4，三維試驗證實為ESBL。 3、CIP敏感組與耐藥組之間的CIP攝入量存在差異(p<0．05)，敏感組細菌CIP的攝入量大于耐藥組；其中耐藥菌Pa4-127株存在藥物聚積的下降，經CCCP處理后，接近為正常水平；6株CIP耐藥菌株gyrA基因83位存在ACC→ATC突變，導致氨基

6、酸Thr→011e的改變，8株CIP耐藥菌株均在gyrA基因132(CAC→CAT)位和parc基因105位(CCT→CCA)存在沉默突變。gyrA基因突變菌株對CIP表現(xiàn)出高水平耐藥，同時對PIP、CPZ、CTX和CAZ也表現(xiàn)較高的耐藥性，但大多數(shù)對IMP敏感。 結論 1、本地區(qū)銅綠假單胞菌產生β-內酰胺酶是其對β-內酰胺類抗生素耐藥的主要機制之一；經檢測有TEM型和AmpC型β-內酰胺酶，其中質粒上攜帶bIaTEM基