銅綠假單胞菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類及喹諾酮類藥物的耐藥性及耐藥基因的研究.pdf

1、目的 了解本地區(qū)臨床分離的銅綠假單胞菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類和喹諾酮類藥物的耐藥情況，為臨床合理用藥提供參考依據(jù)；對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌進(jìn)行基因分型，了解其同源性；重點(diǎn)研究銅綠假單胞菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的特性和對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制。 方法 l、用瓊脂稀釋法檢測β-內(nèi)酰胺類和喹諾酮類藥物對(duì)70株銅綠假單胞菌臨床分離株的MIC，并檢測泵抑制劑CCCP對(duì)MIC的影響；用Nitrocefin顯色法對(duì)銅綠假單胞菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行

2、定性檢測；改良三維試驗(yàn)檢測AmpC酶和ESBLs；對(duì)多重耐藥株選用ERIC2為引物，進(jìn)行PCR分型，確定其同源性。 2、用特異性引物對(duì)質(zhì)粒和染色體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以確定產(chǎn)酶基因的位置及類型；IEF電泳檢測細(xì)菌所產(chǎn)TEMβ-內(nèi)酰胺酶的pI；對(duì)TEM基因進(jìn)行DNA序列測定和同源性分析，并對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)。 3、從臨床銅綠假單胞菌中篩選出CIP耐藥菌10珠和敏感菌10珠，分別對(duì)兩組進(jìn)行CIP攝取實(shí)驗(yàn)，并對(duì)II類拓?fù)洚悩?gòu)酶

3、gyrA和parc基因的QRDR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用限制性內(nèi)切酶SacII對(duì)保守區(qū)進(jìn)行酶切，并用PCR-SSCP技術(shù)篩查其基因突變，最后用序列分析明確突變基因。 結(jié)果 1、70株銅綠假單胞菌對(duì)PIP的耐藥率最高為35．7％，最低為IMt的7．1％，對(duì)AMK也較低，為11．4％，對(duì)其他11種抗菌藥物的耐藥率在17．1％～32．9％之間。外排泵陽性株為4株；所試菌40株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，其中6株菌高產(chǎn)AmpC酶，2株產(chǎn)ESBLs

4、；ERIC2引物可將2C株多重耐藥銅綠假單胞菌分成個(gè)7基因型。 2、僅8株銅綠假單胞菌分離出一個(gè)約7kb的質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增4株TEM基因陽性，DNA序列測定分析2株產(chǎn)廣譜酶TEM-1，另2株產(chǎn)TEM型ESBLs(SHV-29和SHV-147)，其中blaSHV．147與blaSHV-29基因高度同源，其所推導(dǎo)的氨基酸序列與blaSHV．29相比較僅有1個(gè)氨基酸殘基的差異(Ala222→Val)，為一種新的質(zhì)粒介導(dǎo)SHV型β-內(nèi)酰

5、胺酶(GenBank登錄號(hào)：DQ279850)；染色體DNA的PCR結(jié)果顯示6株菌ampC基因呈陽性；重組表達(dá)的TEM-147β-內(nèi)酰胺酶pI約為5．4，三維試驗(yàn)證實(shí)為ESBL。 3、CIP敏感組與耐藥組之間的CIP攝入量存在差異(p<0．05)，敏感組細(xì)菌CIP的攝入量大于耐藥組；其中耐藥菌Pa4-127株存在藥物聚積的下降，經(jīng)CCCP處理后，接近為正常水平；6株CIP耐藥菌株gyrA基因83位存在ACC→ATC突變，導(dǎo)致氨基

6、酸Thr→011e的改變，8株CIP耐藥菌株均在gyrA基因132(CAC→CAT)位和parc基因105位(CCT→CCA)存在沉默突變。gyrA基因突變菌株對(duì)CIP表現(xiàn)出高水平耐藥，同時(shí)對(duì)PIP、CPZ、CTX和CAZ也表現(xiàn)較高的耐藥性，但大多數(shù)對(duì)IMP敏感。 結(jié)論 1、本地區(qū)銅綠假單胞菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是其對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要機(jī)制之一；經(jīng)檢測有TEM型和AmpC型β-內(nèi)酰胺酶，其中質(zhì)粒上攜帶bIaTEM基