T-2毒素影響K562細(xì)胞向紅系細(xì)胞分化的分子機(jī)理研究.pdf

1、T-2毒素是由鐮刀菌產(chǎn)生的毒性最強(qiáng)的A族單端孢霉烯族毒素，是全球糧谷類(lèi)最常見(jiàn)的污染性霉菌毒素。動(dòng)物或人食入被該毒素污染的食物會(huì)導(dǎo)致食物中毒性白細(xì)胞缺乏癥、單端孢霉烯族中毒癥、大骨節(jié)病、人畜赤霉糧中毒癥和克山病等多種疾病。臨床上，中毒癥狀主要表現(xiàn)為拒食、腹瀉、嘔吐、貧血、免疫力下降、內(nèi)臟器官的出血、骨髓組織的壞死、母畜不孕或流產(chǎn)甚至死亡。
　　造血系統(tǒng)是T-2毒素的主要靶器官之一，它對(duì)造血系統(tǒng)的損傷作用以及對(duì)外周血樣的毒性作用大于同

2、類(lèi)毒素。毒素進(jìn)入機(jī)體后引起造血器官損傷，導(dǎo)致骨髓組織壞死，影響多能干細(xì)胞的功能，使多種血液成分的數(shù)量比例失衡，表現(xiàn)為:骨髓和脾臟紅髓細(xì)胞損傷、骨髓發(fā)育不全、血液系統(tǒng)內(nèi)造血細(xì)胞數(shù)目顯著減少、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和容積下降、貧血以及紅細(xì)胞溶血等癥狀。正常動(dòng)物體內(nèi)的紅細(xì)胞是由多能干細(xì)胞向紅系細(xì)胞分化而來(lái)的，因此，為了闡釋T-2毒素引起造血系統(tǒng)損傷的作用機(jī)理，研究T-2毒素影響造血干細(xì)胞分化的分子作用機(jī)理是非常必要的。然而，前人對(duì)多能干細(xì)胞向紅系細(xì)胞的分

3、化進(jìn)行研究，僅得到了參與分化過(guò)程的部分基因家族和信號(hào)通路，并未對(duì)紅系分化的分子機(jī)理進(jìn)行系統(tǒng)研究，且毒素影響多能干細(xì)胞向紅系細(xì)胞分化過(guò)程的分子機(jī)理目前鮮有研究。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期以處于多能干細(xì)胞階段的K562細(xì)胞為模型，發(fā)現(xiàn)T-2毒素可抑制K562細(xì)胞的紅系分化過(guò)程，并用基因芯片和二維電泳技術(shù)對(duì)基因和蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，得到了981個(gè)差異表達(dá)基因和22個(gè)差異表達(dá)蛋白。本課題在本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上對(duì)差異表達(dá)基因和蛋白進(jìn)行篩

4、選，得到了可能參與紅系分化的8個(gè)差異表達(dá)基因和4個(gè)差異表達(dá)蛋白，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western bolt、RNAi和流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)T-2毒素作用下基因的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平以及細(xì)胞分化水平進(jìn)行檢測(cè)，探討T-2毒素抑制K562細(xì)胞向紅系細(xì)胞分化的分子作用機(jī)理，為揭示單端孢霉烯族毒素的血液系統(tǒng)毒性作用機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　本課題首先在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，篩選T-2毒素作用下表達(dá)水平變化較大(Folds≥2)的基

5、因和蛋白，在此篩選結(jié)果的基礎(chǔ)上選擇陰性對(duì)照組(0.6 mM丁酸鈉)中表達(dá)水平變化趨勢(shì)與T-2毒素處理組相反，且在陽(yáng)性對(duì)照組(1 mM H2O2)中表達(dá)水平變化趨勢(shì)與T-2毒素處理組相同的基因和蛋白。對(duì)基因芯片的結(jié)果進(jìn)行分析篩選，得到了8個(gè)可能參與T-2毒素抑制紅系分化過(guò)程的基因，分別是:PI3K、MS4A3、EPAS1、ZNF382、SQSTM1、INSIG1、KDM4D和GPSM2。對(duì)二維電泳的結(jié)果分析后得到了HSP27、PRDX3、

6、PSMC2和ACTR1A等4個(gè)可能與紅系分化有關(guān)的差異表達(dá)蛋白。
　　為研究T-2毒素抑制多能干細(xì)胞向紅系分化的調(diào)控途徑，本實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置空白對(duì)照組、T-2毒素處理組和T-2毒素與信號(hào)通路抑制劑共處理組，不同化合物分別與細(xì)胞共孵育24 h和48 h后，用CD235a-FITC抗體與紅細(xì)胞表面特異性抗原CD235a結(jié)合，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD235a的表達(dá)量，從而判斷細(xì)胞的紅系分化率。通過(guò)比較不同處理組中CD235a表達(dá)量的變化，發(fā)

7、現(xiàn)JAK2-STAT3信號(hào)通路促進(jìn)紅系分化，而NF-κB信號(hào)通路則抑制紅系分化過(guò)程，且T-2毒素可通過(guò)JAK2-STAT3、p38、ERK、JNK和NF-KB信號(hào)通路調(diào)控K562細(xì)胞向紅系分化的過(guò)程。
　　為檢測(cè)T-2毒素與篩選所得基因和蛋白間的關(guān)系，用15 nM T-2毒素分別處理細(xì)胞2h、6h、12h、24 h和48 h后，提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)各基因的mRNA表達(dá)水平與T-2毒素間的時(shí)效關(guān)系。在基因表達(dá)水平變化最顯著的時(shí)間點(diǎn)

8、用信號(hào)通路抑制劑分別預(yù)處理細(xì)胞后，再加入T-2毒素，結(jié)果表明，T-2毒素可通過(guò)JAK2正調(diào)控HSP27、PSMC2、SQSTM1和ZNF382基因的表達(dá)水平，且負(fù)調(diào)控ACTR1A基因的表達(dá)水平;通過(guò)STAT3抑制PI3K、ACTR1A、INSIG1和PRDX3基因的表達(dá)，而對(duì)HSP27、SQSTM1、EPAS1和KDM4D基因的表達(dá)起促進(jìn)作用;通過(guò)p38信號(hào)通路對(duì)INSIG1和PRDX3基因的表達(dá)水平進(jìn)行負(fù)調(diào)控，但可促進(jìn)HSP27基因的

9、表達(dá)水平;也可通過(guò)JNK正調(diào)控SQSTM1和ZNF382基因的表達(dá)水平，負(fù)調(diào)控ACTR1A基因的表達(dá)水平;亦可通過(guò)ERK信號(hào)通路促進(jìn)SQSTM1、EPAS1和ZNF382基因的表達(dá);還可通過(guò)NF-κB信號(hào)通路使KDM4D、SQSTM1和ZNF382基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)，且抑制ACTR1A基因的表達(dá)。
　　隨后，運(yùn)用RNA干擾技術(shù)使目的基因表達(dá)沉默，對(duì)MS4A3基因在紅系分化中的作用進(jìn)行了深入研究。用脂質(zhì)體(Lipofectami

10、neTM2000)轉(zhuǎn)染自身帶有熒光信號(hào)的siRNA，顯微鏡下觀察發(fā)射熒光信號(hào)的細(xì)胞，通過(guò)計(jì)算發(fā)射熒光信號(hào)的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。當(dāng)加入siRNA的劑量為30 ng時(shí)轉(zhuǎn)染效率在70％以上，且細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，符合實(shí)驗(yàn)要求，即K562細(xì)胞適合用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA的方法使基因表達(dá)沉默。用多項(xiàng)研究已證明了的對(duì)任何基因表達(dá)水平無(wú)顯著影響的siRNA作為陰性對(duì)照，用看家基因GAPDH的特異性siRNA作為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)30 ng

11、時(shí)GAPDH的表達(dá)水平極顯著下調(diào)，這說(shuō)明該方法可行，且GAPDH可作為RNA干擾實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照。本課題還設(shè)計(jì)了兩條特異性使目的基因MS4A3表達(dá)沉默的siRNA序列(s2609和s2610)，經(jīng)檢測(cè)s2609比s2610穩(wěn)定性強(qiáng)，且符合實(shí)驗(yàn)要求。MS4A3的表達(dá)被沉默后，K562細(xì)胞的紅系分化率下調(diào)極顯著，表明MS4A3在紅系分化中起促進(jìn)作用;檢測(cè)篩選所得的其他基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與干擾前相比，GATA-1和HSP27基因的表達(dá)

12、水平上調(diào)極顯著，ZNF382和SQSTM1基因的表達(dá)水平極顯著下調(diào)，這表明這些基因位于MS4A3的下游，且MS4A3基因正調(diào)控ZNF382和SQSTM1基因的表達(dá)，而對(duì)GATA-1和HSP27基因的表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用;對(duì)HSP27的基因和蛋白水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)T-2毒素可通過(guò)MS4A3基因?qū)SP27-GATA-1的表達(dá)水平起抑制作用，從而抑制K562細(xì)胞的紅系分化過(guò)程。
　　綜上所述，本課題首先對(duì)本實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果進(jìn)行了分析篩選，得

13、到了可能參與T-2毒素影響造血干細(xì)胞向紅系細(xì)胞分化過(guò)程的8個(gè)差異表達(dá)基因和4個(gè)差異表達(dá)蛋白;通過(guò)對(duì)T-2毒素與信號(hào)通路的關(guān)系、信號(hào)通路與基因（蛋白）的關(guān)系和T-2毒素與基因（蛋白）的調(diào)控關(guān)系進(jìn)行了研究，找到了T-2毒素調(diào)控紅系分化的重要信號(hào)通路，以及這些信號(hào)通路對(duì)篩選所得基因（蛋白）的調(diào)控作用;首次對(duì)MS4A3基因在紅系分化過(guò)程中的作用進(jìn)行研究，得到了MS4A3基因與其他紅系分化相關(guān)基因間的調(diào)控關(guān)系，確定了該基因在紅系分化過(guò)程中的重要作