Hemin誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系細(xì)胞分化和胞質(zhì)雜交體的蛋白質(zhì)組學(xué)及NPM1功能的初步研究.pdf

1、隨著生命科學(xué)研究的發(fā)展和深入，細(xì)胞分化、去分化和再分化逐漸成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。研究表明，在基因水平利用基因?qū)牖蚣?xì)胞工程技術(shù)，可以糾正遺傳物質(zhì)缺陷及基因表達(dá)異常，使失控的癌細(xì)胞向正常方向轉(zhuǎn)化。此外，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究提供了新思路。因此在基因和蛋白質(zhì)水平研究細(xì)胞分化、去分化和再分化的機(jī)制可為腫瘤的發(fā)生及治療提供重要依據(jù)。
　　 正常情況下，哺乳類(lèi)紅細(xì)胞終末分化是由骨髓造血干細(xì)胞依次歷經(jīng)紅系定向祖

2、細(xì)胞、原幼紅細(xì)胞、早幼紅細(xì)胞、中幼紅細(xì)胞、晚幼紅細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞等不同的發(fā)育分化階段，其終末分化的主要特征是分化的紅系細(xì)胞停止分裂并開(kāi)始表達(dá)血紅蛋白，細(xì)胞體積逐漸縮小、細(xì)胞核固縮、偏位、自然排核等，形成網(wǎng)織紅細(xì)胞，通過(guò)血腦屏障進(jìn)入到外周血中發(fā)育為成熟紅細(xì)胞。在正常分化過(guò)程中如果受到物理、化學(xué)、環(huán)境等因素的影響，紅系細(xì)胞則停止分化，異常增殖，細(xì)胞停滯在分化階段，珠蛋白等終末分化相關(guān)基因關(guān)閉，細(xì)胞發(fā)生癌變。這些明顯的分化特征是紅系細(xì)胞特有的

3、，而其它類(lèi)型細(xì)胞所不具備的。
　　 據(jù)報(bào)道，已有多種細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑如:氯高鐵血紅素(hemin)、二甲基亞砜(Dimethysulfoxide，DMSO)、丁酸鈉(Sodiumbutyrate，NaBu)、六甲基烯二乙酰胺（Hexamethylenebisacetamide，HMBA）和全反式維甲酸(ATRA)等，這些誘導(dǎo)劑可在體外誘導(dǎo)紅白血病細(xì)胞，使細(xì)胞發(fā)生重編程，重新進(jìn)入紅系分化階段，細(xì)胞增殖速度減慢，珠蛋白基因開(kāi)啟并表達(dá)血

4、紅蛋白。
　　 此外，胞質(zhì)雜交體模型是研究胞質(zhì)因子對(duì)細(xì)胞調(diào)控的很好模型，該模型是利用正常分化的無(wú)細(xì)胞核的網(wǎng)織紅細(xì)胞與異常分化的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)篩選即可獲得胞質(zhì)雜交體(cybride)。由于胞質(zhì)雜交體中的網(wǎng)織紅細(xì)胞的胞質(zhì)因子可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，使腫瘤細(xì)胞惡性逆轉(zhuǎn)。
　　 迄今，研究與紅系分化相關(guān)的特異性調(diào)節(jié)因子主要集中在紅系分化早期階段，而時(shí)序性進(jìn)入紅系終末分化，尤其是與正常紅系細(xì)胞排核相關(guān)的調(diào)控因子尚無(wú)確切

5、報(bào)道，而白血病細(xì)胞的核增殖和分裂是失控的。深入、系統(tǒng)地研究并闡明細(xì)胞的分化與去分化（癌變）的機(jī)制，是生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　 本論文選用誘導(dǎo)劑Hemin誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化和小鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞與人K562細(xì)胞融合得到的胞質(zhì)雜交體這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥鳛檠芯繉?duì)象，利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)高通量地篩選哺乳類(lèi)紅系終末分化過(guò)程中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，從中篩選與分化、去分化相關(guān)的因子，蛋白質(zhì)復(fù)合體乃至構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)。這些調(diào)控因

6、子的鑒定對(duì)于闡明紅系細(xì)胞終末分化的機(jī)制及開(kāi)發(fā)治療紅白血病的靶向特異性藥物具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 Hemin誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化系統(tǒng):利用Hemin作為分化誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化，用聯(lián)苯胺染色檢測(cè)紅系分化的指標(biāo)，即血紅蛋白的表達(dá);用細(xì)胞計(jì)數(shù)法和MTT比色法分別檢測(cè)hemin對(duì)K562細(xì)胞增殖和細(xì)胞活力的影響;用流式細(xì)胞術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)等方法對(duì)hemin誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化前后細(xì)胞周期分布、紅系分化

7、表面標(biāo)志等進(jìn)行時(shí)序性觀測(cè)。同時(shí)利用雙向電泳偶聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析了hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞在紅系分化過(guò)程中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，經(jīng)分析鑒定從中篩選差異蛋白并對(duì)其功能進(jìn)行初步研究。
　　 胞質(zhì)雜交體系統(tǒng):用鹽酸苯肼誘發(fā)小鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞，利用細(xì)胞融合技術(shù)，將小鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞與K562細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，構(gòu)建了胞質(zhì)雜交體。并通過(guò)抗性篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞株。在基因水平上對(duì)其分別在細(xì)胞分化、增殖、凋亡、癌基因等方面進(jìn)行鑒定;用MTT比色法

8、檢測(cè)了胞質(zhì)雜交體的細(xì)胞活力，利用雙向電泳偶聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)及生物信息學(xué)分析了網(wǎng)織紅細(xì)胞胞質(zhì)因子在對(duì)K562細(xì)胞調(diào)控過(guò)程中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并從篩選重要的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能研究。
　　 hemin誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化結(jié)果表明:K562細(xì)胞經(jīng)hemin誘導(dǎo)24h時(shí)，K562細(xì)胞已經(jīng)表達(dá)血紅蛋白，聯(lián)苯胺染色呈陽(yáng)性，說(shuō)明K562細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)始向紅系分化，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)誘導(dǎo)率逐漸升高，且每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨著誘導(dǎo)劑濃度的升高，誘導(dǎo)效率逐漸升高，96h時(shí)，

9、40μM的hemin誘導(dǎo)效率達(dá)到72％;細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)和MTT檢測(cè)細(xì)胞活力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:hemin對(duì)K562細(xì)胞的增殖和細(xì)胞活力有一定的影響，但在一定時(shí)間范圍內(nèi)不同濃度的hemin對(duì)K562細(xì)胞的細(xì)胞活力影響不明顯;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞細(xì)胞周期結(jié)果表明:hemin并未影響K562細(xì)胞的細(xì)胞周期分布;免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)了紅系分化的表面標(biāo)志TER119和GPA的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種蛋白在細(xì)胞分化過(guò)程中都有表達(dá)且主要定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中;雙向

10、電泳分離了hemin誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化前后表達(dá)的差異蛋白，經(jīng)質(zhì)譜鑒定有66個(gè)蛋白差異表達(dá)，經(jīng)生物信息學(xué)分析對(duì)這些蛋白按功能進(jìn)行了分類(lèi)并做了初步總結(jié)，主要包括以下幾類(lèi):血紅蛋白及其合成相關(guān)的蛋白、mRNA轉(zhuǎn)錄和加工及蛋白質(zhì)翻譯修飾相關(guān)的蛋白、氧化還原代謝相關(guān)的蛋白、細(xì)胞遷移及細(xì)胞骨架系統(tǒng)相關(guān)蛋白、各種代謝相關(guān)的酶類(lèi)、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白及一些功能未知的蛋白。
　　 胞質(zhì)雜交體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:小鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞與K562細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞融合

11、和篩選獲得了穩(wěn)定的細(xì)胞株MR.K562;其增殖相關(guān)基因c-myc表達(dá)下調(diào)，紅系分化特異性基因gata-1表達(dá)上調(diào);MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)定株的細(xì)胞活力，結(jié)果表明與正常K562細(xì)胞相比MR.K562細(xì)胞增殖速度減慢，對(duì)hemin的敏感性增強(qiáng);通過(guò)雙向電泳和質(zhì)譜鑒定，該模型鑒定出64個(gè)差異蛋白，并對(duì)這些蛋白依功能進(jìn)行了分類(lèi)和初步總結(jié)，功能分類(lèi)主要包括:能量代謝相關(guān)蛋白、信號(hào)通路相關(guān)蛋白、蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、運(yùn)輸、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移及細(xì)

12、胞骨架系統(tǒng)相關(guān)、細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白及一些功能未知的蛋白。
　　 另一重要發(fā)現(xiàn)是核仁磷酸蛋白(Nucleophosmin，NPM1)在這兩個(gè)系統(tǒng)中均有差異表達(dá)，據(jù)報(bào)道NPM1是個(gè)多功能蛋白，其在核糖體合成、中心體復(fù)制、組蛋白分子伴侶、胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等多方面都發(fā)揮重要功能，但其在哺乳動(dòng)物紅系分化中功能尚未明確。此外，本實(shí)驗(yàn)前期研究也發(fā)現(xiàn)NPM1在丁酸鈉(SB)誘導(dǎo)MEL細(xì)胞向紅系分化中表達(dá)下調(diào)、胎肝造血系統(tǒng)中亦差異表達(dá)，故選擇核仁

13、磷酸蛋白NPM1對(duì)其在哺乳動(dòng)物紅系分化中進(jìn)行初步功能研究。(1)應(yīng)用Westernblot驗(yàn)證了NPM1在誘導(dǎo)分化和胞質(zhì)雜交體中均差異表達(dá)。(2)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)和過(guò)表達(dá)技術(shù)分別構(gòu)建pLKO.1-NPM1干擾載體和pLJM-NPM1過(guò)表達(dá)載體，用慢病毒包裝技術(shù)侵染K562細(xì)胞并篩選獲得了NPM1低表達(dá)的K562-NPM1-shRNA穩(wěn)定株和NPM1過(guò)表達(dá)的K562-pLJM-NPM1穩(wěn)定株。(3)通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和Hemin誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)

14、，檢測(cè)NPM1低表達(dá)和過(guò)表達(dá)分別對(duì)K562細(xì)胞的活力和分化能力的影響。(4)運(yùn)用串聯(lián)親和純化(TAP)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)分離鑒定與NPM1相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合體，此部分實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。為進(jìn)一步探討NPM1在紅系分化過(guò)程中的功能及作用機(jī)制奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 綜上所述，本論文選取了兩個(gè)研究紅系分化的模型，其優(yōu)勢(shì)在于，hemin誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅細(xì)分化是利用化學(xué)誘導(dǎo)劑直接作用于有核的K562細(xì)胞，重新開(kāi)啟其珠蛋白基因，誘導(dǎo)其重編程