苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞γ珠蛋白基因表達(dá)和向紅系分化的研究.pdf

1、研究背景及目的: β珠蛋白生成障礙性貧血(βthalassemia)是世界上最常見的常染色體單基因缺陷所致的遺傳性疾病，也是對人類健康影響最大的慢性溶血性貧血病，其分子病理基礎(chǔ)是由于β珠蛋白基因的突變或缺失，造成α珠蛋白肽鏈與非α珠蛋白肽鏈之間的不平衡，過剩的α肽鏈造成紅細(xì)胞成熟缺陷和無效生成，最終使患者出現(xiàn)溶血性貧血。本病在世界范圍內(nèi)分布廣，發(fā)病率高，危害大，長期以來珠蛋白一直是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，常被作為遺傳病的重要

2、范例。目前除通過社區(qū)篩查、遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷等預(yù)防手段控制患者出生外，至今對重型和部分中間型β珠蛋白生成障礙性貧血患者的治療仍有較大難度：規(guī)律輸血并配合除鐵劑，平均壽命僅達(dá)30歲左右；脾切除及脾動(dòng)脈栓塞只對部分中間型β珠蛋白生成障礙性貧血患者有一定的療效；造血干細(xì)胞移植能夠根治，但相合配型的供體難尋、移植難度大而又費(fèi)用高昂，限制了其廣泛應(yīng)用；目前最有前景的治療方法是基因治療(gene therapy)，廣義的基因治療包括基因矯正治療和基

3、因調(diào)控治療，基因矯正治療是指運(yùn)用DNA重組技術(shù)修復(fù)患者細(xì)胞中有缺陷的基因，使細(xì)胞恢復(fù)功能而達(dá)到治療遺傳病的目的；理論上β珠蛋白生成障礙性貧血此類單基因遺傳病是基因矯正治療最理想的模型，但因諸多技術(shù)難題至今尚未解決，目前仍停留于基礎(chǔ)研究階段。 研究方法: 一、苦參堿對K562細(xì)胞增殖抑制與誘導(dǎo)向紅系分化的研究方法 1．苦參堿對K562細(xì)胞增殖抑制的影響：K562細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，在37℃、5

4、％CO<,2>條件下培養(yǎng)。①臺(tái)盼藍(lán)拒染活細(xì)胞計(jì)數(shù)：取指數(shù)生長期K562細(xì)胞，以5×10<'4>cells/mL密度接種于培養(yǎng)瓶中。分設(shè)苦參堿濃度為0.05g/L、0.10g/L和0.20g/L的3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，只加等量培養(yǎng)液的陰性對照組和丁酸鈉濃度為0.5mmol/L的陽性對照組。從接種當(dāng)時(shí)起每隔24 h取部分細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)拒染活細(xì)胞計(jì)數(shù)，連續(xù)計(jì)數(shù)6d。②XTT法：取指數(shù)生長期K562細(xì)胞，制成1×10<'4>cells/mL的細(xì)胞懸液，設(shè)

5、培養(yǎng)液組(只加培養(yǎng)液-本底背景)、苦參堿組(濃度分別為o0.05g/L、0.10g/L和0.20g/L)、陰性對照組(未加任何藥處理)和陽性對照組(丁酸鈉濃度為0.5mmol/L)，于d 3檢測苦參堿對K562細(xì)胞增殖抑制的劑量效應(yīng)。 2．苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化的影響：①聯(lián)苯胺染色檢測苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞血紅蛋白的表達(dá)：細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組見臺(tái)盼藍(lán)拒染活細(xì)胞計(jì)數(shù)，從接種當(dāng)時(shí)起每隔24 h先進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)拒染活細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞

6、活力在95％以上時(shí)，再取部分細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)苯胺染色，計(jì)算聯(lián)苯胺染色陽性細(xì)胞率(BZ％)，連續(xù)計(jì)數(shù)6 d。②Wright-Gimesa染色檢測苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化：將陰性對照組及0.10g/L苦參堿誘導(dǎo)d 4的K562細(xì)胞，分別離心制作細(xì)胞涂片，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的改變。 二、苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞γ珠蛋白基因表達(dá)的研究方法 1．Western blotting檢測苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞胎兒血紅蛋白(HbF)的合成

7、：做劑量效應(yīng)時(shí)，收集0.05g/L、0.10g/L和0.20g/L濃度苦參堿和0.5mmol/L丁酸鈉誘導(dǎo)d 4及陰性對照組K562細(xì)胞；做時(shí)間效應(yīng)時(shí)，分別在d 3、d 4、d 5收集0.10g/L，苦參堿誘導(dǎo)后及陽性對照組、陰性對照組細(xì)胞。對上述收集的細(xì)胞提取總蛋白，先做蛋白定量，再以β-actin作為看家基因，應(yīng)用Westem blotting獲得各組HbF及相對應(yīng)的β-actin的蛋白印跡結(jié)果，通過凝膠分析軟件進(jìn)行蛋白條帶的灰度測

8、定，用各組HbF條帶的灰度值除以各自相對應(yīng)的內(nèi)參β-actin的灰度值，進(jìn)行蛋白上樣量的校正，再以校正后的陰性對照組的表達(dá)量作為“1”，計(jì)算出各組相對于陰性對照組的倍數(shù)，對所得倍數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 2．實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞γ珠蛋白基因mRNA的表達(dá)：采用相對定量解析方法進(jìn)行mRNA表達(dá)量的分析。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行樣品間擴(kuò)增效率校正；選擇β-actin作為參比基因?qū)λ袠悠愤M(jìn)行歸一化處理(RNA量校正)

9、。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)以高濃度總RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為樣品，用EASY Dilution對樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋后，構(gòu)建相對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。做劑量效應(yīng)時(shí)，收集0.05g/L 0.10g/L和0.20g/L濃度苦參堿和0.5mmol/L丁酸鈉誘導(dǎo)d3及陰性對照組細(xì)胞；做時(shí)間效應(yīng)時(shí)，分別在d2、d3、d4時(shí)收集0.10g/L苦參堿誘導(dǎo)后及陽性對照組、陰性對照組細(xì)胞。對所收集的細(xì)胞提取總RNA，對其進(jìn)行質(zhì)量鑒定后，行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)

10、，調(diào)整待測樣品濃度，使所得Ct值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，然后與標(biāo)準(zhǔn)樣品同時(shí)分管進(jìn)行擴(kuò)增，得到的各個(gè)目的基因及看家基因mRNA的Ct值分別代入各自對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以看家基因的定量結(jié)果作為“1”，計(jì)算出各組相對于看家基因的倍數(shù)，即為誤差校正后的總RNA量。再以校正后的陰性對照組的表達(dá)量作為“1”，計(jì)算出各組相對于陰性對照組的倍數(shù)，對所得倍數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 結(jié)果: 一、苦參堿對K562細(xì)胞增殖抑制與誘導(dǎo)向紅系分化的結(jié)果 1．

11、苦參堿對K562細(xì)胞增殖抑制的影響：通過臺(tái)盼藍(lán)拒染活細(xì)胞計(jì)數(shù)和XTT法檢測，苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞后不同時(shí)間之間有顯著差異(P=0.000)；不同濃度苦參堿誘導(dǎo)后的細(xì)胞數(shù)之間有顯著差異(P=0.000)。各濃度苦參堿對K562細(xì)胞增殖均有抑制作用，增殖抑制程度隨苦參堿濃度的增大抑制作用增加。苦參堿能夠以劑量依賴的方式抑制K562細(xì)胞的增殖。 2．苦參堿誘導(dǎo)K562~胞向紅系分化的影響：①聯(lián)苯胺染色檢測苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞血紅蛋

12、白(Hb)合成：不同濃度苦參堿誘導(dǎo)不同時(shí)間聯(lián)苯胺染色陽性細(xì)胞率(BZ％)有顯著差異(P=0.000)?？鄥A能以劑量依賴和時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)K562細(xì)胞Hb合成，在0.10g/L濃度苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞d 4 BZ％達(dá)到高峰15.7％。②Wright-Gimesa染色檢測苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：未誘導(dǎo)的K562細(xì)胞表現(xiàn)為未分化的祖細(xì)胞形態(tài)；誘導(dǎo)后的K562細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上出現(xiàn)向紅系分化的特征。 二、苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)

13、胞Y珠蛋白基因表達(dá)的結(jié)果 1.Western blotting檢測苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞胎兒血紅蛋白(HbF)的合成：0.05g/L、0.10g/L和0.20g/L濃度的苦參堿及丁酸鈉誘導(dǎo)K562細(xì)胞d 4 HbF合成增加倍數(shù)分別為1.08、1.53、1.36和1.52。0.10g/L、0.20g/L濃度的苦參堿與陰性對照間有顯著差異(P<0.01)；0.10g/L濃度苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞d 3、d 4、d 5時(shí)及丁酸鈉誘導(dǎo)d

14、 3時(shí)HbF合成增加倍數(shù)分別為1.38、1.81、1.54、1.92?？鄥A誘導(dǎo)K562細(xì)胞d 3、d 4、d 5合成的HbF均與陰性對照組間有顯著差異(P<0.01)?？鄥A能以劑量依賴和時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)K562細(xì)胞合成HbF。在0.10g/L濃度苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞d 4達(dá)到最佳劑量和時(shí)間效應(yīng)。 2.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞γ，珠蛋白基因mRNA的表達(dá)：①<'A>γ珠蛋白基因mRNA的表達(dá)：各濃

15、度苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞d 3及0.10g/L濃度苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞d 2、d3和d4時(shí)，γ珠蛋白基因mRNA的表達(dá)均與陰性對照組間無顯著差異(P>0.05)。②<'G>γ珠蛋白基因mRNA的表達(dá)：0.05g/L、0.10g/L和0.20g/L濃度苦參堿及丁酸鈉誘導(dǎo)K562細(xì)胞d 3 <'G>γ珠蛋白基因mRNA表達(dá)增加倍數(shù)分別為：1.40、2.72、2.20和3.39。O.10g/L、0.20g/L苦參堿與陰性對照間有顯著差異(P

16、<0.05)；苦參堿誘導(dǎo)d 2、d 3和d 4及丁酸鈉誘導(dǎo)d 3時(shí)K562細(xì)胞<'G>γ珠蛋白基因mRNA表達(dá)增加倍數(shù)分別為1.57、3.08、2.54和3.45。3個(gè)不同天數(shù)的苦參堿誘導(dǎo)后的<'G>γ珠蛋白基因mRNA的表達(dá)均與陰性對照組間有顯著差異(P<0.01)。故苦參堿能以劑量依賴及時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)K562細(xì)胞<'G>γ珠蛋白基因mRNA表達(dá)。在0.10g/L濃度苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞d 3達(dá)到最佳劑量和時(shí)間效應(yīng)；苦參堿誘導(dǎo)K

17、562細(xì)胞γ珠蛋白基因mRNA表達(dá)增加，主要是通過誘導(dǎo)<'G>γ珠蛋白基因mRNA表達(dá)增加實(shí)現(xiàn)的。 結(jié)論: 1．聯(lián)苯胺染色顯示：苦參堿能夠以劑量依賴及時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)K562細(xì)胞血紅蛋白的合成。 2．Westem blotting檢測結(jié)果顯示：苦參堿能夠以劑量依賴及時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)K562細(xì)胞血紅蛋白F的合成，這表明苦參堿通過誘導(dǎo)K562細(xì)胞血紅蛋白F的表達(dá)而促使血紅蛋白的合成。 3．實(shí)時(shí)熒光定量RT

18、-PCR檢測結(jié)果顯示：苦參堿能夠以劑量依賴及時(shí)間依賴的方式上調(diào)K562細(xì)胞<'G>γ珠蛋白mRNA表達(dá)，而對<'A>γ珠蛋白mRNA表達(dá)無明顯作用。這表明苦參堿是通過上調(diào)<'G>γ珠蛋白mRNA的表達(dá)誘導(dǎo)K562細(xì)胞血紅蛋白F的合成。 4．苦參堿能夠誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化，具有與丁酸鈉相同的誘導(dǎo)γ珠蛋白基因的表達(dá)，是一種低毒、價(jià)廉的γ珠蛋白基因誘導(dǎo)劑。 5．本研究為藥物誘導(dǎo)調(diào)控治療β珠蛋白生成障礙性貧血提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依