南瓜蛋白誘導K562細胞凋亡的分子機制及協(xié)同STI571抗K562細胞作用的研究.pdf

1、藥物治療是惡性腫瘤的三大療法之一。近年來，誘導凋亡和分化療法為腫瘤的藥物治療開辟了新的途徑，也取得了一定成效，但仍缺乏理想的誘導凋亡和分化的藥物。對天然活性物質(zhì)進行抗腫瘤作用的研究，尤其在誘導凋亡和分化方面進行探索，將有助于獲得理想的抗腫瘤藥物。 植物來源的核糖體失活蛋白(ribosome-inactivatingproteins，RIPs)具有抗生育、抗病毒和抗腫瘤等多種生物學活性，其抗腫瘤活性尤其受到關注。南瓜蛋白(Cucu

2、rmosin)是本課題組從南瓜的瓜瓤中提取的一種新的RIP，本文將對其體內(nèi)外抗腫瘤活性及抗腫瘤機制進行研究，旨在為其潛在的抗腫瘤臨床應用提供理論基礎和實驗依據(jù)。 一、Cucurmosin體內(nèi)外抗腫瘤活性及誘導K562細胞凋亡的研究 體外試驗(invitro)結果表明，Cucurmosin對人慢性粒細胞白血病細胞株K562和小鼠黑色素瘤細胞株B16具有較強的殺傷作用，呈明顯的量效和時效關系。MTT法檢測表明，陽性對照藥天花

3、粉蛋白(TCS)抑制K562細胞增殖的ICso值比Cucurmosin大4倍多，提示Cucurmosin對腫瘤細胞的體外殺傷作用強于TCS。 體內(nèi)試驗(invivo)結果表明，Cucurmosin對小鼠B16黑色素瘤和Lewis肺癌移植性實體瘤具有明顯抑制作用，作用呈劑量依賴性。對B16黑色素瘤和Lewis肺癌的最大抑瘤率分別為55．2％和65．5％。用藥期間未觀察到明顯的毒性作用，說明Cucurmosin具有良好的體內(nèi)抗腫瘤活

4、性。 以K562細胞作為研究對象，觀察Cucurmosin促凋亡作用。形態(tài)學觀察(AO／EB熒光雙染法、電鏡超微結構觀察)發(fā)現(xiàn)，K562細胞出現(xiàn)染色質(zhì)濃集、核固縮、核碎裂及凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)學改變；DNA瓊脂糖電泳顯示DNA有特征性“梯級”斷裂：流式細胞儀DNA倍體分析檢出典型的亞二倍體(sub-G1)凋亡峰。Cucurmosin(2．5ug／m1)作用24h、48h和72h，凋亡率分別為17．2％、35．5％和47．9％

5、，呈明顯的時間依賴性。上述結果充分說明，Cucurmosin具有誘導K562細胞凋亡的作用。 二、Cucurmosin誘導K562細胞凋亡分子機制的探討 K562細胞是一種人慢性粒細胞白血病(CML)細胞株，對化療藥物誘導的細胞凋亡具有很強的抵抗性，而抗凋亡機理主要與其P210bcr／abl蛋白具有很強的酪氨酸激酶(tyrosinekinase,TK)活性有關。通過抑制bcr／abl融合基因表達或下調(diào)P210her／au

6、蛋白水平，或拮抗其TK活性，將有效促進K562細胞凋亡。Westernblot結果顯示，Cucurmosin顯著下調(diào)K562細胞P2lobcr／abl蛋白水平，呈明顯的時間和濃度依賴性。RT-PCR結果顯示，Cucurmosin對K562細胞bcr／ablmRNA表達無明顯影響。熱休克蛋白90(Hsp90)是P210bcr／abl蛋白的分子伴侶(molecularchaperone)，對P210bcr／abl蛋白具有保護作用。Weste

7、rnblot結果顯示，Cucurmosin下調(diào)K562細胞Hsp90表達，這將促使P210bcr／~U蛋白降解。因此，我們推測Cucurmosin下調(diào)P210bet／au蛋白水平與其具有核糖體失活活性及下調(diào)Hsp90表達有關。 已知促凋亡因子誘導腫瘤細胞凋亡的信號通路主要有兩條：死亡受體激活通路和擾亂線粒體功能通路。我們研究發(fā)現(xiàn)，K562細胞在Cucurmosin作用下線粒體跨膜電位(△ψm)呈時間依賴性下降，同時胞漿Cyt-c

8、濃度明顯上升，caspase-3被活化，說明Cucurmosin可通過干擾線粒體功能促使K562細胞凋亡。在線粒體凋亡通路中，Bcl-2家族起著重要的調(diào)控作用。Westernblot結果顯示，Cucurmosin下調(diào)K562細胞抗凋亡蛋白Bcl-xL表達，同時上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達。 此外，Westernblot結果顯示，Cucurmosin下調(diào)c-Myc表達，作用呈時間依賴性。 三、Cucurmosin與STl571

9、的體外聯(lián)合抗K562細胞作用 Cucurmosin可下調(diào)K562細胞P210bcr／abl蛋白水平，STl571對K562細胞P210bcr／abl的酪氨酸激酶(TK)活性具有競爭性抑制作用，提示兩藥通過不同方式對K562細胞P210bcr／abl的TK活性將產(chǎn)生雙重抑制作用。因此，我們推測兩藥具有協(xié)同抗K562細胞的作用。MTT法顯示，Cucurmosin與STl571合用對K562細胞增殖的抑制率大于兩藥相應濃度單獨應用的抑

10、制率，大多數(shù)聯(lián)合用藥組合q值>1．15，表明兩藥合用對K562細胞體外殺傷有協(xié)同作用。流式細胞儀檢測表明，兩藥具有協(xié)同促K562細胞凋亡的作用。Westernblot結果顯示，Cucurmosin和STl571聯(lián)合用藥，對K562細胞p210bcr／abl蛋白自身酪氨酸磷酸化的抑制作用比兩藥單用更為顯著，說明兩藥對K562細胞P210bcr／abl蛋白的TK活性具有雙重抑制作用，這也是它們發(fā)揮協(xié)同作用的主要原因。 綜上所述，Cu