環(huán)氧合酶2高表達(dá)及siRNA沉默其基因?qū)m頸癌生物學(xué)行為的影響.pdf

1、一、未絕經(jīng)宮頸癌患者腫瘤組織中環(huán)氧合酶2的表達(dá)及其意義
　　 目的：探討環(huán)氧合酶2(COX-2)在宮頸癌組織中的表達(dá)與月經(jīng)周期的關(guān)系及其臨床意義。
　　 方法：選取47例未絕經(jīng)宮頸癌手術(shù)病人，病史結(jié)合子宮內(nèi)膜HE染色觀察判斷患者所處月經(jīng)周期時段，采用免疫組織化學(xué)SABC法檢測宮頸癌組織中COX-2及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)，計算機(jī)圖像分析COX-2免疫染色密度值，計數(shù)PCNA標(biāo)記指數(shù)(LI)。
　　 結(jié)果

2、：47例宮頸癌病人，增生期患者COX-2表達(dá)陽性率較分泌期無顯著性差異，但陽性患者表達(dá)強(qiáng)于分泌期。宮頸癌組織中COX-2表達(dá)水平與PCNA LI值呈顯著正相關(guān)性。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部肌層浸潤者COX-2表達(dá)陽性率高于無轉(zhuǎn)移者，宮頸癌組織中COX-2的表達(dá)與FIGO臨床分期、組織分化程度無顯著相關(guān)性。
　　 結(jié)論：未絕經(jīng)宮頸癌患者腫瘤組織中COX-2的表達(dá)在增生期較分泌期明顯增強(qiáng)，并參與調(diào)節(jié)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移。
　　 二、雌、

3、孕激素對宮頸癌Hela細(xì)胞環(huán)氧合酶-2表達(dá)的影響
　　 目的：研究17-β雌二醇(E2)、甲羥孕酮(MPA)對Hela細(xì)胞腫瘤相關(guān)基因COX-2表達(dá)的影響。
　　 方法：將培養(yǎng)的Hela細(xì)胞分為對照組、無水乙醇組、E2組、E2＋MPA組和MPA組，分別用相應(yīng)藥物處理24h，Western blot、RT-PCR方法檢測COX-2蛋白及mRNA表達(dá)變化，同時采用免疫細(xì)胞化學(xué)SABC法染色檢測COX-2，PCNA在Hela細(xì)

4、胞的表達(dá)，計算機(jī)圖像分析PCNA免疫染色平均光密度值。
　　 結(jié)果：正常培養(yǎng)的Hela細(xì)胞即有COX-2蛋白表達(dá)，E2可顯著上調(diào)其蛋白及mRNA表達(dá)，而MPA、MPA＋E2組 COX-2的蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)。各組PCNA平均光密度值E2組平均光密度較對照組高，差異顯著，E2＋MPA組和MPA組顯著降低。
　　 結(jié)論：Hela細(xì)胞中COX-2的表達(dá)受女性激素的調(diào)控，E2上調(diào)其表達(dá)，MPA、E2＋MPA下調(diào)其表達(dá)

5、，并可能因此影響Hela細(xì)胞的增殖活性。
　　 三、COX-2 siRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建及其效應(yīng)檢測
　　 目的：構(gòu)建可在真核細(xì)胞表達(dá)COX-2 siRNA的真核表達(dá)載體，并檢測其對Hela細(xì)胞COX-2表達(dá)的抑制效應(yīng)，為研究COX-2基因的功能提供前提條件。
　　 方法：選擇COX-2的全長基因序列作為分析序列，采用Ambion公司軟件和siRNA 設(shè)計原則，設(shè)計兩條特異的siRNA 靶序列，體外合成發(fā)卡狀s

6、iRNA序列，以亞克隆法經(jīng)BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)分別克隆入Pgenesil-1載體，即Pgenesil-C1、Pgenesil-C2，插入一段等長隨機(jī)序列的P-Control作為陰性對照。經(jīng)PstI和SalI酶切鑒定和測序后，以脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染至人宮頸癌Hela細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染48h分別用RT-PCR和Western blot方法評價對COX-2表達(dá)的抑制效應(yīng)。
　　 結(jié)果：酶切鑒定和測序結(jié)果證實(shí)發(fā)卡狀siRNA序列成功

7、連接到Pgenesil-1載體，轉(zhuǎn)染Pgenesil-C1、 Pgenesil-C2后48h，Hela細(xì)胞COX-2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著降低，效率分別達(dá)87％、53％。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了針對COX-2基因的siRNA真核表達(dá)載體，Pgenesil-C1可以有效抑制COX-2基因的表達(dá)。
　　 四、RNAi沉默環(huán)氧合酶-2基因?qū)m頸癌Hela細(xì)胞細(xì)胞周期影響及其機(jī)制的實(shí)驗研究
　　 目的：利用RNA

8、干擾(RNAi)抑制宮頸癌Hela細(xì)胞COX-2表達(dá)研究其對細(xì)胞周期的影響及其機(jī)制。
　　 方法：以脂質(zhì)體法將COX-2小干擾RNA(siRNA)真核表達(dá)載體質(zhì)粒Pgenesil-C1轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞系，對照質(zhì)粒P-Control作為對照組。分別用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞的增殖活性，流式細(xì)胞技術(shù)檢測Hela細(xì)胞細(xì)胞周期改變，用Western blot方法檢測cyclinD1及cyclinE蛋白的表達(dá)變化。
　　

9、 結(jié)果：轉(zhuǎn)染Pgenesil-C1后細(xì)胞增殖活性受到顯著抑制，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Pgenesil-C1后Hela細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞較對照組顯著增多，而S期和G2/M細(xì)胞較對照組顯著減少，同時cyclinD1及cyclin E蛋白表達(dá)顯著降低，轉(zhuǎn)染后96h凋亡細(xì)胞較對照組增多，凋亡率為3.25％。
　　 結(jié)論：利用RNAi技術(shù)抑制COX-2表達(dá)可以降低Hela細(xì)胞增殖活性，可能通過下調(diào)cyclinD1及cyclin E

10、的表達(dá)使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。
　　 五、COX-2基因表達(dá)下調(diào)對宮頸癌Hela細(xì)胞順鉑化療敏感性的影響及其機(jī)制研究
　　 目的：利用RNA干擾(RNAi)抑制Hela細(xì)胞COX-2表達(dá)后凋亡相關(guān)基因表達(dá)的變化，研究COX-2對Hela細(xì)胞順鉑(CDDP)化療敏感性影響及其作用機(jī)制。
　　 方法：構(gòu)建特異性COX-2小干擾RNA(siRNA)真核表達(dá)載體質(zhì)粒Pgenesil-C1，以脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染至Hel

11、a細(xì)胞系，隨機(jī)序列質(zhì)粒P-Control作為對照組，G418篩選陽性克隆，用不同濃度CDDP作用于各組Hela細(xì)胞12h，用MTT檢測Hela細(xì)胞的存活率，流式細(xì)胞技術(shù)檢測Hela細(xì)胞凋亡率的變化。用RT-PCR方法檢測Survivin、Bax和Bcl-2 mRNA的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：MTT結(jié)果顯示Hela細(xì)胞存活率隨CDDP濃度升高而降低，Pgenesil-C1組較對照組降低更為顯著，流式細(xì)胞儀分析顯示轉(zhuǎn)染Pgenesi