化學(xué)合成siRNA沉默宮頸癌SiHa細(xì)胞E6基因表達(dá)的深入研究.pdf

1、高危型人乳頭瘤病毒基因整合到人宮頸上皮細(xì)胞染色體后，原癌基因E6、E7及所表達(dá)的原癌蛋白在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要的作用。E6、E7蛋白分別與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子P53、pRb相互作用，干預(yù)細(xì)胞周期進(jìn)程導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。因而E6、E7成為HPV陽性宮頸癌基因治療的理想靶標(biāo)。RNAi作為一種用于基因功能和基因治療研究的工具，具有特異性高、穩(wěn)定性好、抑制作用強(qiáng)、細(xì)胞攝取容易等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于病毒基因功能及基因治療研究。 本實(shí)驗(yàn)借助

2、化學(xué)合成的特異HPV16 E6基因的siRNA作用于HPV16表達(dá)陽性的人宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞株，觀察E6基因表達(dá)的特異性沉默情況；檢測該siRNA能否同時(shí)抑制E7基因的表達(dá)，即是否可引起E6、E7基因表達(dá)的共抑制：進(jìn)一步探討RNAi對SiHa細(xì)胞在分子水平上所產(chǎn)生的一系列影響。為深入認(rèn)識宮頸癌的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)，同時(shí)也為RNAi技術(shù)用于治療HPV感染及宮頸癌提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： (1)按照siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)

3、HPV16 E6基因特異性siRNA，序列經(jīng)BLAST進(jìn)行同源性分析，確保與人類基因編碼序列無同源性。 (2)借助脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000將siRNA轉(zhuǎn)入SiHa細(xì)胞。 (3)轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測E6、E7 mRNA的表達(dá)情況；轉(zhuǎn)染后72h提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，Westem Blot檢測P53、pRb、VEGF-C、Survivin蛋白的表達(dá)情況

4、。RT-PCR擴(kuò)增條帶與蛋白質(zhì)條帶均用分析軟件進(jìn)行灰度分析。 結(jié)果： (1)半定量RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染特異性HPV16 E6 siRNA后24h、48h、72h細(xì)胞內(nèi)E6 mRNA的相對表達(dá)量與脂質(zhì)體對照組相比分別減少了65.5％、62.7％、59.5％，P<0.05; E7 mRNA的相對表達(dá)量與脂質(zhì)體對照組相比分別減少了63.9％、67.1％、58.3％，P<0.05。 (2) Westem Blot檢測

5、轉(zhuǎn)染72h后的細(xì)胞內(nèi)P53、pRb、VEGF-C和Survivin蛋白的表達(dá)情況，與脂質(zhì)體對照組相比P53蛋白的表達(dá)增加了108.4％，P<0.05; pRb蛋白的表達(dá)增加了76.5％，P<0.05；VEGF-C的表達(dá)減少了28.7％，P<0.05；實(shí)驗(yàn)組Survivin蛋白的表達(dá)情況與脂質(zhì)體對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。 結(jié)論： (1)本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的特異性HPV16 E6 siRNA在轉(zhuǎn)染入SiHa細(xì)胞后，能