太空誘變宮頸癌細(xì)胞差異表達(dá)基因的篩選及其功能初步研究.pdf

1、目的：本研究利用前期構(gòu)建的地面對(duì)照和太空誘變宮頸癌CaSki細(xì)胞株消減文庫，篩選在地面對(duì)照和太空誘變宮頸癌CaSki細(xì)胞中差異表達(dá)的基因，并對(duì)其功能進(jìn)行研究。
　　 方法：利用消減雜交文庫制備反向Northem雜交膜，對(duì)48A9CaSki細(xì)胞和對(duì)照CaSki細(xì)胞進(jìn)行同位素探針標(biāo)記，而后反向Northern雜交，通過放射性自顯影篩選差異性表達(dá)基因。通過RNAi方法和構(gòu)建真核表達(dá)載體方法，分別抑制和增加差異性表達(dá)基因的表達(dá)，利用MT

2、T、流式細(xì)胞術(shù)、裸鼠成瘤等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CaSki細(xì)胞生物學(xué)性狀的變化，進(jìn)而檢測(cè)細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性，用RT-PCR和Western blot檢驗(yàn)此基因作用機(jī)制。
　　 結(jié)果：1.我們篩選到33個(gè)差異表達(dá)基因，涉及細(xì)胞骨架、細(xì)胞分化凋亡、基因轉(zhuǎn)錄等。我們利用太空這一特殊環(huán)境得到了和腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因，為研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。其中STCl基因是我們比較感興趣的一個(gè)差異表達(dá)基因。
　　 2.STCl基因在宮頸癌

3、組織中的表達(dá)弱于正常組織。MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，STCl基因沉默組(CaSki/siSTCl)細(xì)胞生長(zhǎng)速度比陰性對(duì)照組(CaSki/siNC)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯加快，集落形成實(shí)驗(yàn)表明集落形成率明顯上升，流式細(xì)胞分析顯示基因沉默組細(xì)胞G1期細(xì)胞減少，細(xì)胞遷移侵襲實(shí)驗(yàn)表明STC1表達(dá)減少后，CaSki細(xì)胞的侵襲遷移能力均上升。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)表明沉默組細(xì)胞成瘤能力增強(qiáng)，這些表明STC1基因可能抑制CaSki細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

4、　　 3.在CaSki細(xì)胞轉(zhuǎn)染STCl真核表達(dá)載體后，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，STC1基因轉(zhuǎn)染組(CaSki/STC1)細(xì)胞生長(zhǎng)速度比陰性空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組(CaSki/NC)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯減慢，集落形成實(shí)驗(yàn)表明集落形成率明顯下降。流式細(xì)胞分析顯示基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞G1期細(xì)胞增加。細(xì)胞遷移侵襲實(shí)驗(yàn)表明STC1表達(dá)增加后，CaSki細(xì)胞的侵襲遷移能力均下降。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)表明STCl基因轉(zhuǎn)染組成瘤能力下降。以上觀測(cè)表明，STC1基因轉(zhuǎn)染CaSk

5、i細(xì)胞后抑制了CaSki細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡。所以STC1基因轉(zhuǎn)染有可能用于腫瘤的治療。
　　 4.順鉑、毒胡蘿卜素和雷帕霉素均抑制了CaSki細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，當(dāng)CaSki細(xì)胞增加STC1基因含量時(shí)，順鉑、毒胡蘿卜素和雷帕霉素對(duì)細(xì)胞的抑制增強(qiáng)，凋亡細(xì)胞增加，這些表明STC1基因增強(qiáng)了CaSki細(xì)胞對(duì)順鉑、毒胡蘿卜素和雷帕霉素藥物的敏感性，為腫瘤的治療提供了新的途徑。
　　 5.無論在mRNA水平

6、還是蛋白水平，當(dāng)CaSki細(xì)胞內(nèi)STC1表達(dá)水平下降時(shí)(RNAi)，NF-kB水平隨之下降；當(dāng)STC1表達(dá)水平上升時(shí)(真核轉(zhuǎn)染STCl—pcDNA3.1(+))，NK—kB表達(dá)水平也隨之上升，表明STC1與NF-kB在表達(dá)水平上呈正相關(guān)。當(dāng)用順鉑(2μg/ml)或毒胡蘿卜素(3pM)刺激CaSki和HeLa細(xì)胞時(shí)，Caspase-3 mRNA表達(dá)量逐漸增加，而STC1與NF-kB也呈現(xiàn)表達(dá)上升趨勢(shì)，且呈正比。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，N

7、F-kB可在細(xì)胞內(nèi)與STC1的啟動(dòng)子發(fā)生結(jié)合。這些結(jié)果表明，核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB在宮頸癌細(xì)胞中和STC1基因啟動(dòng)子結(jié)合啟動(dòng)了STC1的表達(dá)，從而誘導(dǎo)了宮頸癌細(xì)胞的凋亡。
　　 結(jié)論：通過構(gòu)建抑制性消減雜交文庫結(jié)合反向Northern dot blot篩選差異性表達(dá)基因的方法，是一種高通量高效率的篩選方法。STC1在宮頸癌細(xì)胞的表達(dá)可抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，并且通過核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的啟動(dòng)發(fā)揮作用。這為進(jìn)一步探討腫瘤的發(fā)