太空誘變宮頸癌細胞差異表達基因的篩選及其功能初步研究.pdf

1、目的：本研究利用前期構(gòu)建的地面對照和太空誘變宮頸癌CaSki細胞株消減文庫，篩選在地面對照和太空誘變宮頸癌CaSki細胞中差異表達的基因，并對其功能進行研究。
　　 方法：利用消減雜交文庫制備反向Northem雜交膜，對48A9CaSki細胞和對照CaSki細胞進行同位素探針標記，而后反向Northern雜交，通過放射性自顯影篩選差異性表達基因。通過RNAi方法和構(gòu)建真核表達載體方法，分別抑制和增加差異性表達基因的表達，利用MT

2、T、流式細胞術(shù)、裸鼠成瘤等實驗檢測CaSki細胞生物學(xué)性狀的變化，進而檢測細胞對抗腫瘤藥物的敏感性，用RT-PCR和Western blot檢驗此基因作用機制。
　　 結(jié)果：1.我們篩選到33個差異表達基因，涉及細胞骨架、細胞分化凋亡、基因轉(zhuǎn)錄等。我們利用太空這一特殊環(huán)境得到了和腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因，為研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制奠定了基礎(chǔ)。其中STCl基因是我們比較感興趣的一個差異表達基因。
　　 2.STCl基因在宮頸癌

3、組織中的表達弱于正常組織。MTT實驗檢測發(fā)現(xiàn)，STCl基因沉默組(CaSki/siSTCl)細胞生長速度比陰性對照組(CaSki/siNC)細胞的生長速度明顯加快，集落形成實驗表明集落形成率明顯上升，流式細胞分析顯示基因沉默組細胞G1期細胞減少，細胞遷移侵襲實驗表明STC1表達減少后，CaSki細胞的侵襲遷移能力均上升。裸鼠成瘤實驗表明沉默組細胞成瘤能力增強，這些表明STC1基因可能抑制CaSki細胞的生長、轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細胞凋亡。

4、　　 3.在CaSki細胞轉(zhuǎn)染STCl真核表達載體后，MTT實驗檢測發(fā)現(xiàn)，STC1基因轉(zhuǎn)染組(CaSki/STC1)細胞生長速度比陰性空載體轉(zhuǎn)染對照組(CaSki/NC)細胞的生長速度明顯減慢，集落形成實驗表明集落形成率明顯下降。流式細胞分析顯示基因轉(zhuǎn)染組細胞G1期細胞增加。細胞遷移侵襲實驗表明STC1表達增加后，CaSki細胞的侵襲遷移能力均下降。裸鼠成瘤實驗表明STCl基因轉(zhuǎn)染組成瘤能力下降。以上觀測表明，STC1基因轉(zhuǎn)染CaSk

5、i細胞后抑制了CaSki細胞的生長、轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)了細胞的凋亡。所以STC1基因轉(zhuǎn)染有可能用于腫瘤的治療。
　　 4.順鉑、毒胡蘿卜素和雷帕霉素均抑制了CaSki細胞的增殖，誘導(dǎo)了細胞凋亡，當(dāng)CaSki細胞增加STC1基因含量時，順鉑、毒胡蘿卜素和雷帕霉素對細胞的抑制增強，凋亡細胞增加，這些表明STC1基因增強了CaSki細胞對順鉑、毒胡蘿卜素和雷帕霉素藥物的敏感性，為腫瘤的治療提供了新的途徑。
　　 5.無論在mRNA水平

6、還是蛋白水平，當(dāng)CaSki細胞內(nèi)STC1表達水平下降時(RNAi)，NF-kB水平隨之下降；當(dāng)STC1表達水平上升時(真核轉(zhuǎn)染STCl—pcDNA3.1(+))，NK—kB表達水平也隨之上升，表明STC1與NF-kB在表達水平上呈正相關(guān)。當(dāng)用順鉑(2μg/ml)或毒胡蘿卜素(3pM)刺激CaSki和HeLa細胞時，Caspase-3 mRNA表達量逐漸增加，而STC1與NF-kB也呈現(xiàn)表達上升趨勢，且呈正比。染色質(zhì)免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，N

7、F-kB可在細胞內(nèi)與STC1的啟動子發(fā)生結(jié)合。這些結(jié)果表明，核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB在宮頸癌細胞中和STC1基因啟動子結(jié)合啟動了STC1的表達，從而誘導(dǎo)了宮頸癌細胞的凋亡。
　　 結(jié)論：通過構(gòu)建抑制性消減雜交文庫結(jié)合反向Northern dot blot篩選差異性表達基因的方法，是一種高通量高效率的篩選方法。STC1在宮頸癌細胞的表達可抑制細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞的凋亡，并且通過核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的啟動發(fā)揮作用。這為進一步探討腫瘤的發(fā)