不同轉(zhuǎn)移能力鼻咽癌細(xì)胞間差異表達(dá)基因的篩選及功能初步研究.pdf

1、鼻咽癌(Nasopharyngealcarcinoma)是我國(guó)南方省份及東南亞高發(fā)的一種惡性腫瘤，具有明顯的種族聚集性和地域性。目前普遍認(rèn)為鼻咽癌是在多種因素協(xié)同作用下，經(jīng)過多步驟、多階段發(fā)生發(fā)展形成的，其發(fā)生可能與遺傳因素、EBV感染、理化環(huán)境因素等[1]有關(guān)。 鼻咽癌具有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移早，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率高等特點(diǎn)，但是目前對(duì)鼻咽癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不十分清楚，進(jìn)一步篩選和鑒定鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，并明確其在鼻咽癌轉(zhuǎn)移過程中的作

2、用，對(duì)于揭示鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制有著重要意義，也對(duì)鼻咽癌的治療及預(yù)后判斷具有重要的理論和實(shí)用價(jià)值。 細(xì)胞的表型由它所表達(dá)的基因種類、表達(dá)水平和時(shí)空順序等因素所決定。通過比較遺傳背景相同、轉(zhuǎn)移能力不同的腫瘤細(xì)胞間的基因表達(dá)差異這一途徑尋找腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，是一種已經(jīng)得到公認(rèn)的篩選策略，但前提條件是要獲得具有相同遺傳背景、轉(zhuǎn)移能力不同的腫瘤細(xì)胞。鼻咽癌細(xì)胞5-8F和6-10B均來源于同一母細(xì)胞株SUNE-1，既往的研究已經(jīng)證實(shí)，5-

3、8F具有高成瘤、高轉(zhuǎn)移能力，而6-10B則只成瘤、不轉(zhuǎn)移。比較基因組雜交(CGH)的研究結(jié)果也表明，5-8F和6-10B細(xì)胞在多條染色體上存在缺失、擴(kuò)增等差異。這兩株細(xì)胞來自同一親本，具有相同的遺傳背景，兩者間的差異主要集中在轉(zhuǎn)移能力上，它們之間的差異表達(dá)基因很可能與鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，是用于尋找鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)候選基因的理想材料。 本研究首先利用抑制性消減雜交技術(shù)，以具有不同轉(zhuǎn)移能力的兩株鼻咽癌細(xì)胞5-8F和6-10B為材料，建立了

4、兩者間差異表達(dá)基因的消減cDNA文庫(kù)并從中篩選出多個(gè)在高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞5-8F中表達(dá)上調(diào)的基因。通過檢索既有文獻(xiàn)中相關(guān)基因功能的報(bào)道，分析這些基因在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中可能的作用。在此基礎(chǔ)上，我們選擇了差異表達(dá)基因Flotillin-2為目標(biāo)進(jìn)行后續(xù)研究。利用RNA干擾技術(shù)選擇性地沉默5-8F細(xì)胞中Flotillin-2基因的表達(dá)，通過觀察Flotillin-2基因被干擾后對(duì)5-8F細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，明確Flotillin-2基因在5-8F

5、細(xì)胞中的作用，為Flotillin-2基因與鼻咽癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下：第一部分：不同轉(zhuǎn)移能力鼻咽癌細(xì)胞間差異表達(dá)基因的篩選采用抑制性消減雜交技術(shù)，以高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞5-8FcDNA為檢測(cè)子，以不轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞6-10BcDNA為驅(qū)趕子，通過兩輪消減雜交和兩輪抑制性PCR，構(gòu)建了兩者間差異表達(dá)基因的消減cDNA文庫(kù)，得到了上千個(gè)差異表達(dá)克隆。從該文庫(kù)中隨機(jī)挑取192個(gè)克隆，采用PCR擴(kuò)增插入cDNA片段，經(jīng)0.4

6、NNaOH裂解變性后，按8×12矩陣方式制備了兩張斑點(diǎn)雜交膜，分別與經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的5-8F細(xì)胞和6-10B細(xì)胞的第一鏈cDNA行反向Northern斑點(diǎn)雜交。雜交信號(hào)經(jīng)掃描和對(duì)比分析后，獲得了差異表達(dá)點(diǎn)，對(duì)存在2倍差異以上的克隆進(jìn)行了序列測(cè)定，獲得了在5-8F細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的20個(gè)差異表達(dá)基因的cDNA序列。通過與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)其中16個(gè)為已知基因(flotilin-2，ezrin,pim-3,fli-1，mel，n

7、eugrin，znf216,ASBl，raly,UBE2A，keratin6A，TMED7,EIF3S9,FTL,RPL21及RPL16)，2個(gè)為通過電子克隆預(yù)測(cè)出的基因(c9orf74和MDS006)，2個(gè)代表新基因序列。這些差異表達(dá)基因的功能涉及到細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、蛋白質(zhì)合成與運(yùn)輸?shù)榷鄠€(gè)方面。除少部分基因(ezrin、fli-1、flotillin-2、pim-3)有過報(bào)道外，大部分基因是首

8、次發(fā)現(xiàn)可能與轉(zhuǎn)移表型有關(guān)，提示在這些差異表達(dá)基因中可能存在鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)候選基因。RT-PCR分析表明，與6-10B相比，F(xiàn)lotillin-2基因在高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞5-8F中的表達(dá)明顯上調(diào)。相關(guān)文獻(xiàn)檢索結(jié)果也提示，F(xiàn)lotillin-2基因有作為鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)候選基因的功能基礎(chǔ)和可能性。 第二部分用RNA干擾技術(shù)研究Flotillin-2基因在5-8F細(xì)胞的作用采用pSUPER.retro逆病毒載體系統(tǒng)，分別構(gòu)建了針對(duì)Flot

9、illin-2的兩個(gè)RNAi載體(shFlot2-1和shFlot2-2)。經(jīng)測(cè)序結(jié)果證實(shí)后，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將shFlot2-1和shFlot2-2分別導(dǎo)入5-8F細(xì)胞，嘌呤霉素篩選獲得抗性克隆，PCR證實(shí)抗性克隆中含有shFlots；RT-PCR結(jié)果表明，shFlot2-1和shFlot2-2表達(dá)載體均特異性的引起Flotillin-2的表達(dá)下調(diào)，對(duì)其它無關(guān)基因沒有影響，而且shFlot2-2比shFlot2-1具有更好的RNA干

10、擾效果；WesternBlotting分析表明5-8F-shFlot2-2細(xì)胞中Flotillin-2的蛋白表達(dá)下調(diào)了75％以上，這些說明我們已成功地建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shFlots的5-8F細(xì)胞系。 隨后，我們進(jìn)一步考察了Flotillin-2的表達(dá)被干擾后對(duì)5-8F細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響。流式細(xì)胞分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pSUPER.retro空白載體的5-8F細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的5-8F細(xì)胞的細(xì)胞周期分布沒有明顯改變；而轉(zhuǎn)染shFlot2-

11、2后可以使5-8F細(xì)胞停滯于G1期，G1期細(xì)胞比例增加(59.11％vs46.28％/44.99％)，S期(30.49％vs39.71％/40.58％)和G2/M期細(xì)胞比例減少(10.41％vs14.01％/14.43％)。 MTT法觀察5-8F-shFlot2細(xì)胞的增殖能力，以轉(zhuǎn)染pSUPER.retro空白載體的5-8F細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染5-8F細(xì)胞作為對(duì)照，觀察5-8F-shFlot2-2細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果表明5-8F-shF

12、lot2細(xì)胞的增殖速度明顯低于對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性(P＜0.05)；雙層軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5-8F-shFlot2-2細(xì)胞形成的集落數(shù)明顯少于對(duì)照組(P＜0.05)。提示Flotillin-2被干擾后導(dǎo)致5-8F細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力降低。 利用劃痕實(shí)驗(yàn)和Matrigel侵襲模型證實(shí)，F(xiàn)lotillin-2被干擾后5-8F細(xì)胞的侵襲能力和運(yùn)動(dòng)能力減弱。裸鼠腹腔內(nèi)接種后成瘤及轉(zhuǎn)移能力的比較分析結(jié)果進(jìn)一步提示，

13、Flotillin-2被干擾后5-8F細(xì)胞的成瘤能力不受影響，轉(zhuǎn)移能力下降。 本實(shí)驗(yàn)利用抑制性消減雜交技術(shù)，構(gòu)建了不同轉(zhuǎn)移能力鼻咽癌細(xì)胞間差異表達(dá)基因的消減cDNA文庫(kù)，利用反向Northern斑點(diǎn)雜交篩選出了20個(gè)在5-8細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)基因，發(fā)現(xiàn)其中16個(gè)為已知基因，2個(gè)為通過電子克隆預(yù)測(cè)出的基因，2個(gè)代表新基因序列，為進(jìn)一步篩選鼻咽癌候選轉(zhuǎn)移相關(guān)基因奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。利用RNA干擾技術(shù)，建立了穩(wěn)定表達(dá)shFlot2的干擾