A型FMDV感染BHK-21細(xì)胞差異表達(dá)基因的篩選和初步分析.pdf

1、口蹄疫病毒(FMDV)是對(duì)偶蹄類家畜如牛、綿羊、山羊和豬等影響最為嚴(yán)重的病毒之一,可以引起口蹄疫(FMD),發(fā)病動(dòng)物的主要癥狀是高熱以及在口、鼻、蹄和母畜乳頭無(wú)毛部位發(fā)形成水皰。口蹄疫病毒除了具有感染性和致病力強(qiáng)、潛伏期短、發(fā)病急,可通過(guò)含毒空氣傳播等特點(diǎn)外,最重要的特點(diǎn)是病原變異性強(qiáng)、具有準(zhǔn)種特征,因此,給該病的控制和消滅增加了難度。如果沒(méi)有得到快速有效的控制,易感動(dòng)物就會(huì)將FMDV傳播給野生動(dòng)物。
　　 表達(dá)譜芯片是基因芯片

2、的一種,它可以從整體上分析細(xì)胞表達(dá)情況,通過(guò)比較不同個(gè)體或物種之間以及同一個(gè)體在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段以及正常和疾病狀態(tài)下基因轉(zhuǎn)錄和其表達(dá)的差異,尋找和發(fā)現(xiàn)新的基因,并研究它們?cè)谏矬w發(fā)育、遺傳、進(jìn)化等過(guò)程中的功能；表達(dá)譜芯片可為研究基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及機(jī)理,揭示不同層次多基因協(xié)同作用的生命過(guò)程提供手段,將在研究許多重大疾病的相關(guān)基因及作用機(jī)理方面發(fā)揮巨大作用。
　　 疾病的發(fā)生與發(fā)展往往伴隨著基因表達(dá)模式的改變,正常宿主基因的表達(dá)和感染病

3、原后宿主基因的表達(dá)存在一定的相關(guān)性和差異,本研究通過(guò)A型FMDV流行毒株(A／WH／CHA／09)和A型FMDV重組毒株分別感染BHK-21細(xì)胞,運(yùn)用包含35,882個(gè)轉(zhuǎn)錄體,其中包括了28853個(gè)己知基因的全轉(zhuǎn)錄組分析芯片-Mouse Gene1.0 ST芯片,對(duì)感染后1h和2h這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的BHK-21細(xì)胞的總RNA進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組比較分析。采用ratio>2倍的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因,結(jié)果顯示A型FMDV流行毒株感染BHK-21細(xì)胞1h

4、后獲得了45個(gè)差異表達(dá)基因,其中16個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和29個(gè)下調(diào)表達(dá)基因；感染后2h獲得了144個(gè)差異表達(dá)基因,其中50個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和94個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。其中上調(diào)表達(dá)的基因主要有組蛋白家族、縫隙連接蛋白、B淋巴細(xì)胞前體基因、凋亡誘導(dǎo)因子等,下調(diào)表達(dá)的基因有真核翻譯起始因子、泛素結(jié)合酶、核糖體蛋白等。而A型口蹄疫病毒重組毒株感染BHK-21細(xì)胞1h后獲得了49條差異表達(dá)基因,其中32個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和17個(gè)下調(diào)表達(dá)基因；感染后2h獲得了17

5、5個(gè)差異表達(dá)基因,其中101個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和74個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。其中,上調(diào)表達(dá)的基因主要有RASD家族、縫隙連接蛋白、凋亡誘導(dǎo)因子等,下調(diào)表達(dá)的基因主要有動(dòng)力蛋白、核糖體核蛋白、核糖體蛋白等。
　　 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)通過(guò)PCR反應(yīng)產(chǎn)物逐漸累積,使熒光信號(hào)強(qiáng)度等比例增加來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)時(shí)定量PCR除了具有普通PCR的優(yōu)點(diǎn)外,還能對(duì)樣品進(jìn)行定量,減少污染,從而擴(kuò)展了PCR技術(shù)的應(yīng)用范疇,是一項(xiàng)具有劃時(shí)代意義的新技術(shù)。本研究用

6、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證了目標(biāo)基因eIF3、UBE2、AIF和Connexin在口蹄疫病毒感染BHK-21細(xì)胞后2h總RNA的表達(dá)量,變化趨勢(shì)與芯片結(jié)果基本一致,證實(shí)了芯片結(jié)果的可靠性。
　　 本研究成功建立了A型口蹄疫病毒感染BHK-21細(xì)胞的表達(dá)譜芯片雜交模型,并篩選出了差異表達(dá)的基因,在此基礎(chǔ)上利用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了芯片結(jié)果的可靠性,以此為平臺(tái)可以進(jìn)一步探討口蹄疫病毒感染BHK細(xì)胞發(fā)病的分子機(jī)制,對(duì)口蹄疫的早