A型FMDV感染BHK-21細胞差異表達基因的篩選和初步分析.pdf

1、口蹄疫病毒(FMDV)是對偶蹄類家畜如牛、綿羊、山羊和豬等影響最為嚴重的病毒之一,可以引起口蹄疫(FMD),發(fā)病動物的主要癥狀是高熱以及在口、鼻、蹄和母畜乳頭無毛部位發(fā)形成水皰?？谔阋卟《境司哂懈腥拘院椭虏×?、潛伏期短、發(fā)病急,可通過含毒空氣傳播等特點外,最重要的特點是病原變異性強、具有準種特征,因此,給該病的控制和消滅增加了難度。如果沒有得到快速有效的控制,易感動物就會將FMDV傳播給野生動物。
　　 表達譜芯片是基因芯片

2、的一種,它可以從整體上分析細胞表達情況,通過比較不同個體或物種之間以及同一個體在不同生長發(fā)育階段以及正常和疾病狀態(tài)下基因轉錄和其表達的差異,尋找和發(fā)現(xiàn)新的基因,并研究它們在生物體發(fā)育、遺傳、進化等過程中的功能；表達譜芯片可為研究基因調(diào)控網(wǎng)絡及機理,揭示不同層次多基因協(xié)同作用的生命過程提供手段,將在研究許多重大疾病的相關基因及作用機理方面發(fā)揮巨大作用。
　　 疾病的發(fā)生與發(fā)展往往伴隨著基因表達模式的改變,正常宿主基因的表達和感染病

3、原后宿主基因的表達存在一定的相關性和差異,本研究通過A型FMDV流行毒株(A／WH／CHA／09)和A型FMDV重組毒株分別感染BHK-21細胞,運用包含35,882個轉錄體,其中包括了28853個己知基因的全轉錄組分析芯片-Mouse Gene1.0 ST芯片,對感染后1h和2h這兩個時間點的BHK-21細胞的總RNA進行了轉錄組比較分析。采用ratio>2倍的標準篩選差異表達基因,結果顯示A型FMDV流行毒株感染BHK-21細胞1h

4、后獲得了45個差異表達基因,其中16個上調(diào)表達基因和29個下調(diào)表達基因；感染后2h獲得了144個差異表達基因,其中50個上調(diào)表達基因和94個下調(diào)表達基因。其中上調(diào)表達的基因主要有組蛋白家族、縫隙連接蛋白、B淋巴細胞前體基因、凋亡誘導因子等,下調(diào)表達的基因有真核翻譯起始因子、泛素結合酶、核糖體蛋白等。而A型口蹄疫病毒重組毒株感染BHK-21細胞1h后獲得了49條差異表達基因,其中32個上調(diào)表達基因和17個下調(diào)表達基因；感染后2h獲得了17

5、5個差異表達基因,其中101個上調(diào)表達基因和74個下調(diào)表達基因。其中,上調(diào)表達的基因主要有RASD家族、縫隙連接蛋白、凋亡誘導因子等,下調(diào)表達的基因主要有動力蛋白、核糖體核蛋白、核糖體蛋白等。
　　 實時定量PCR技術通過PCR反應產(chǎn)物逐漸累積,使熒光信號強度等比例增加來實時監(jiān)控擴增產(chǎn)物。實時定量PCR除了具有普通PCR的優(yōu)點外,還能對樣品進行定量,減少污染,從而擴展了PCR技術的應用范疇,是一項具有劃時代意義的新技術。本研究用

6、實時熒光定量PCR技術驗證了目標基因eIF3、UBE2、AIF和Connexin在口蹄疫病毒感染BHK-21細胞后2h總RNA的表達量,變化趨勢與芯片結果基本一致,證實了芯片結果的可靠性。
　　 本研究成功建立了A型口蹄疫病毒感染BHK-21細胞的表達譜芯片雜交模型,并篩選出了差異表達的基因,在此基礎上利用熒光定量PCR技術進一步驗證了芯片結果的可靠性,以此為平臺可以進一步探討口蹄疫病毒感染BHK細胞發(fā)病的分子機制,對口蹄疫的早