INPP4B對宮頸癌細胞生長增殖的調(diào)控及其在宮頸癌中的表達.pdf

1、宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)2012年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球每年新發(fā)宮頸癌病例大約53萬，其中約80％的病例在發(fā)展中國家。因此在發(fā)展中國家宮頸癌已成為女性中僅次于乳腺癌的第二殺手。
　　高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染和兩種病毒癌蛋白E6/E7的持續(xù)表達是誘導(dǎo)宮頸癌發(fā)生的主要因素。然而，在HPV感染人群中只有少數(shù)發(fā)展為宮頸癌，說明HPV感染是宮頸癌發(fā)生的必要但不充分條件。高危型

2、HPV感染促進了細胞向惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)展，病毒感染后細胞基因的不穩(wěn)定性導(dǎo)致的突變積累以及細胞內(nèi)蛋白表達的變化是正常細胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細胞的關(guān)鍵步驟。
　　磷脂酰肌醇4-磷酸酶Ⅱ型(INPP4B)是PI3K/AKT通路中的一種磷酸酶，其主要底物是磷脂酰肌醇3，4-二磷酸鹽[PI(3，4)P2]，INPP4B催化水解[PI(3，4)P2]的4位磷酸基團生成磷脂酰肌醇3-磷酸鹽[PI(3)P]，降低[PI(3，4)P2]的水平。還有文獻報道IN

3、PP4B可以直接水解[PI(3，4，5)P3]中的4位磷酸基團，減少[PI(3，4，5)P3]。通過這些反應(yīng)INPP4B可抑制AKT的活性。已有研究表明，作為PI3K/AKT途徑中的負調(diào)因子，INPP4B參與調(diào)控細胞增殖，細胞遷移，DNA損傷反應(yīng)等過程。
　　近幾年臨床與生物學研究佐證了INPP4B在腫瘤中的復(fù)雜作用。在乳腺癌、卵巢癌和黑色素瘤等腫瘤的雜合性缺失譜分析中發(fā)現(xiàn)INPP4B的雜合性缺失與患者存活率下降密切相關(guān)。在前列腺

4、癌、乳腺癌和黑色素瘤中，INPP4B可通過抑制AKT活性阻礙腫瘤細胞的增殖、侵襲以及小鼠移植瘤的生長。然而，也有研究表明INPP4B在結(jié)腸癌、急性白血病(acute myeloid leukemia，AML)以及黑色素瘤中發(fā)揮了致癌活性，INPP4B通過激活SGK3(serum-andglucocorticoid-regulated kinase3，SGK3)途徑促進細胞的生長增殖。所以，INPP4B的作用具有腫瘤甚至細胞特異性。迄今為

5、止，INPP4B在宮頸癌中的表達及其對宮頸癌細胞的作用尚未見報道，本研究通過體內(nèi)外實驗探索了INPP4B對宮頸癌細胞生長增殖、周期和凋亡的影響及其分子機制，并進一步觀察分析了INPP4B在臨床宮頸癌標本中的表達狀況。
　　1.INPP4B抑制宮頸癌細胞的生長增殖
　　目的:研究INPP4B對宮頸癌細胞生長增殖的影響。方法:將INPP4B表達質(zhì)粒LHCX-INPP4B轉(zhuǎn)染INPP4B表達缺失的HeLa細胞，SiHa細胞以及C3

6、3a細胞，通過CCK-8實驗，BrdU實驗以及克隆形成實驗檢測上述宮頸癌細胞的生長增殖。同時利用細胞凋亡檢測試劑盒檢測INPP4B對細胞凋亡的影響。在INPP4B高表達的CaSki細胞中采用INPP4B特異性siRNA干擾其表達，用克隆形成及BrdU實驗檢測細胞的增殖活性。結(jié)果: CCK-8和克隆形成實驗顯示，過表達INPP4B使宮頸癌細胞活性和克隆形成能力明顯下降，BrdU實驗表明，轉(zhuǎn)染INPP4B后宮頸癌細胞進入S期的細胞比例減少。

7、特異性siRNA干擾實驗結(jié)果表明，敲低INPP4B表達促進了CaSki細胞的生長增殖。但過表達INPP4B對上述宮頸癌細胞的細胞凋亡無明顯影響。結(jié)論:INPP4B可抑制宮頸癌細胞的生長增殖和細胞周期進程，但對宮頸癌細胞凋亡沒有明顯促進作用。
　　2.INPP4B表達對宮頸癌細胞中AKT活性的影響
　　目的:觀察宮頸癌細胞中INPP4B表達對AKT活性的影響。方法:在HeLa，SiHa和C33a細胞中過表達INPP4B，在Ca

8、Ski細胞中敲低INPP4B表達，48h后收集細胞蛋白行western blot檢測。結(jié)果:與對照細胞相比，過表達INPP4B導(dǎo)致HeLa和C33a細胞中pAKT表達含量降低，但敲低INPP4B表達對CaSki細胞中pAKT水平?jīng)]有明顯影響。結(jié)論:INPP4B抑制宮頸癌細胞增殖的作用可能部分依賴于其對AKT活性的負調(diào)控。
　　3.HPV E6/E7蛋白對宮頸癌細胞INPP4B表達的影響
　　目的:探討HPV E6/E7轉(zhuǎn)化蛋

9、白對INPP4B表達的影響。方法:選擇高表達INPP4B并有HPV16 E6，E7表達背景的CaSki細胞，采用特異性siRNA單獨敲低E6表達或同時敲低E6和E7表達，western blot檢測有關(guān)蛋白的表達。結(jié)果:敲低E6、以及E6/E7表達后，CaSki細胞中p53蛋白水平增加，pAKT表達水平明顯降低，INPP4B表達輕度降低。結(jié)論: HPV E6/E7癌蛋白可促進宮頸癌細胞中pAKT活性增高，并有可能通過PI3K/AKT途徑

10、的反饋調(diào)節(jié)影響INPP4B的表達。
　　4.INPP4B抑制裸鼠體內(nèi)宮頸癌細胞移植瘤的生長
　　目的:通過體內(nèi)實驗進一步驗證INPP4B對宮頸癌細胞生長增殖的抑制作用。方法:利用本室構(gòu)建的INPP4B穩(wěn)轉(zhuǎn)宮頸癌細胞株GV367-INPP4B HeLa，注射小鼠皮下建立裸鼠成瘤實驗?zāi)Ｐ?。成瘤后進行動物活體成像拍照以及裸鼠移植瘤重量，大小等指標的分析，觀察INPP4B過表達對宮頸癌移植瘤生長的影響。結(jié)果:與對照GV367-HeL

11、a細胞相比，穩(wěn)定表達INPP4B蛋白的GV367-INPP4BHeLa細胞在裸鼠體內(nèi)的生長速度明顯緩慢，最終形成腫瘤的大小和重量也明顯低于對照組。結(jié)論:過表達INPP4B可在體內(nèi)抑制裸鼠宮頸癌異體移植瘤的生長。
　　5.臨床宮頸組織中INPP4B蛋白的表達
　　目的:研究正常宮頸以及宮頸鱗癌組織中INPP4B的表達情況。方法:收取臨床正常宮頸以及宮頸鱗狀細胞癌組織，real time-PCR以及免疫組化方法檢測INPP4B的

12、表達。結(jié)果:免疫組化表明，66例宮頸鱗癌組織中，INPP4B陽性率為39.4％，INPP4B缺失率接近60％。在43例正常宮頸鱗狀上皮中，INPP4B陽性率為32.5％。統(tǒng)計學分析表明，正常宮頸與宮頸癌組織中INPP4B的表達水平?jīng)]有顯著差異，real time PCR與免疫組化的結(jié)果一致。上述結(jié)果與Oncomine數(shù)據(jù)庫中的已有數(shù)據(jù)相符。結(jié)論:INPP4B表達在正常宮頸組織與宮頸鱗癌組織中沒有明顯差異。我們分析正常宮頸組織中INPP4

13、B的表達率較低的原因，可能與正常宮頸細胞中缺少改變細胞生長的刺激因素，使INPP4B表達未被充分誘導(dǎo)有關(guān)。
　　綜上所述，本研究利用體內(nèi)外實驗探究了INPP4B對宮頸癌細胞生長增殖的影響，并初步觀察了INPP4B在臨床宮頸標本中的表達特點。研究發(fā)現(xiàn):1）過表達INPP4B對宮頸癌細胞生長增殖有抑制作用。2）INPP4B過表達可抑制裸鼠體內(nèi)宮頸癌細胞移植瘤的生長。3)INPP4B對宮頸癌細胞生長增殖的抑制作用部分依賴于其對于AKT活