siRNA抑制人宮頸癌細(xì)胞eIF4E基因的表達(dá)及其影響.pdf

1、[目的]
　　 觀察化學(xué)合成siRNA沉默eIF4E表達(dá)的可行性,并優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。檢測(cè)siRNA對(duì)Hela細(xì)胞eIF4E基因表達(dá)的抑制作用及對(duì)靶細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響,探討eIF4E基因?qū)ela細(xì)胞的生物學(xué)意義。
　　 [方法]
　　 化學(xué)合成4對(duì)針對(duì)eIF4E的siRNA序列,用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞。RT-PCR檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組mRNA表達(dá)量的變化,篩選出沉默效果最好的siRNA。將篩選出的沉默效

2、果最好的siRNA轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,設(shè)置空白對(duì)照組,分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h,48h,72h時(shí)eIF4E mRNA和蛋白的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化,免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞eIF4E和VEGF蛋白表達(dá)水平的變化。
　　 [結(jié)果]
　　 1.4對(duì)siRNA(eIF4E siRNA-1、eIF4E siRNA-2、eIF4E siRNA-3、e

3、IF4E siRNA-4)對(duì)eIF4E mRNA抑制率分別為19.654％、59.260%、29.883%、48.598%,以siRNA-2作用效果最為明顯。
　　 2.同空白對(duì)照組相比,siRNA-2轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞24h、48h、72h后均可觀察到靶基因mRNA和蛋白的表達(dá)量降低,對(duì)靶基因mRNA的抑制率分別為48.236%、59.093%、65.477%,對(duì)靶基因蛋白的抑制率分別為32.750%、78.677%、84.13

4、7%。
　　 3.siRNA-2轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞72h后G0/G1期比例增加9.639±0.655%,S期細(xì)胞比例減少7.28±0.536%(P＜0.01)。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst33258染色分析siRNA-2轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞24h、48h、72h后,均未檢測(cè)到明顯的凋亡。
　　 5.siRNA-2轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后,Hela細(xì)胞的增殖活性明顯降低,72h抑制率達(dá)到最大(32.143±3.031

5、,P＜0.01)。
　　 6.siRNA-2干擾Hela細(xì)胞eIF4E基因后,eIF4E和VEGF的陽(yáng)性強(qiáng)度明顯降低,提示二者具有相關(guān)性。
　　 [結(jié)論]
　　 對(duì)Hela細(xì)胞的eIF4E基因進(jìn)行瞬時(shí)干擾,能夠有效抑制eIF4E的表達(dá),抑制效果具有時(shí)間依賴性。eIF4E基因的表達(dá)受到抑制后,明顯抑制Hela細(xì)胞的增殖,改變細(xì)胞周期,下調(diào)eIF4E和VEGF蛋白的表達(dá),但未明顯的誘導(dǎo)出凋亡,提示eIF4E可作為腫瘤