醒腦靜注射液對(duì)大鼠腦損傷后細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的： 創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumaticbraininjuryTBI)是一種嚴(yán)重的腦組織損傷，有很高的致死率及致殘率。在腦損傷的致傷機(jī)制中，繼發(fā)性腦損傷占有很重要的角色，它的嚴(yán)重程度決定了患者的預(yù)后。大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，細(xì)胞凋亡(apoptosis)是繼發(fā)性腦損傷重要的細(xì)胞死亡形式。醒腦靜注射液主要成分有麝香、冰片、梔子、郁金等，是一種中藥復(fù)方制劑，近年來，醒腦靜注射液逐漸開始用于顱腦外傷的治療，并取得了一定的療效。本試驗(yàn)的目的

2、是觀察醒腦靜注射液對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)后細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax及Caspase-3表達(dá)的影響，探討醒腦靜對(duì)腦外傷后細(xì)胞凋亡的影響和可能機(jī)制，為臨床治療腦損傷提供理論依據(jù)。 方法： 普通級(jí)Wistar雄性大鼠108只，體重300-350g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)將動(dòng)物分為假手術(shù)組、損傷對(duì)照組和醒腦靜注射液治療組，每組36只，每組再分為傷后6h、12h、24h、48h、72h和168h6個(gè)亞組，每亞組6

3、只。假手術(shù)組僅行開顱術(shù)，另兩組采用改進(jìn)的Feeney法制作大鼠TBI模型，醒腦靜注射液治療組在傷后10min內(nèi)腹腔內(nèi)注射醒腦靜注射液20ml/kg，每日一次至造模結(jié)束；損傷對(duì)照組則腹腔內(nèi)注射等量的0.9％氯化鈉溶液。然后分別按各時(shí)間點(diǎn)將動(dòng)物斷頭處死，立即取出全腦組織，置于4％的中性甲醛溶液中固定備用。組織切片為常規(guī)石蠟切片。應(yīng)用末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的生物素脫氧尿嘧啶核苷酸缺口末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleoti

4、dyltransferasemediatedbiotin-dUTPnickendlabeling，TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(Streptavidin/Peroxidase，SP)法進(jìn)行Bcl-2、Bax、caspase-3的免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)。在400高倍光學(xué)顯微鏡下觀察TUNEL及Bcl-2、Bax、caspase-3免疫反應(yīng)的結(jié)果，計(jì)算每張標(biāo)本隨機(jī)5

5、個(gè)視野的平均陽性細(xì)胞數(shù)。 結(jié)果： 免疫組化檢測(cè)見Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白陽性表達(dá)主要在胞漿和核膜著色，呈彌漫性或散在性棕黃色顆粒。Bcl-2蛋白表達(dá)在傷后6h下降，在損傷后72h表達(dá)值達(dá)到最低。而治療組Bcl-2蛋白表達(dá)下降在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)無顯著變化，24h后兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Bax蛋白表達(dá)在傷后6h增強(qiáng)，48～72h達(dá)高峰，傷后7d明顯下降，治療組的蛋白表達(dá)較損傷組降低，72h以后兩組

6、比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Caspase-3蛋白表達(dá)在傷后6小時(shí)可見，24h后表達(dá)增加，3d達(dá)高峰，治療組蛋白表達(dá)降低，1d后兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)在細(xì)胞核上，呈棕黃色顆粒，正常腦組織內(nèi)有很少的TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)，傷后6小時(shí)表達(dá)開始增加，72小時(shí)達(dá)到高峰。治療組陽性細(xì)胞較損傷組減少，48h后兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論： 從研究中發(fā)現(xiàn)，醒腦靜注射液對(duì)凋亡具有抑制作用

7、，作用從損傷后24h開始，72h以后逐漸達(dá)到高峰。關(guān)于醒腦靜注射液防治腦損傷導(dǎo)致的腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，分析認(rèn)為與這種藥物具有顯著的清除自由基及拮抗細(xì)胞因子的作用有關(guān)。氧自由基與興奮性氨基酸在顱腦外傷后的過度釋放可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞鈣通道開放，細(xì)胞內(nèi)鈣離子大量積聚，引起鈣超載，而氧自由基和鈣超載正是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的重要因素。因此本研究結(jié)果提示，醒腦靜注射液的神經(jīng)保護(hù)作用可能通過減少細(xì)胞凋亡及調(diào)整相關(guān)基因蛋白Bcl-2、Bax、Caspase