醒腦靜注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用.pdf

1、研究背景：腦血管疾病是目前危害人類健康的三大疾病之一，其中，缺血性腦血管疾病以其高發(fā)病率，高致殘率和高死亡率，而嚴重危害著人們的身體健康。 腦缺血損傷以往認為是由急性能量衰竭導致的細胞壞死所造成的，但腦循環(huán)障礙未進一步加重時，神經(jīng)功能缺損仍進行性加重，神經(jīng)元的急性壞死顯然無法解釋，從以往動物實驗觀察到，這種延遲損傷的機制主要為凋亡。20世紀90年代以來，人們發(fā)現(xiàn)腦缺血后神經(jīng)損傷中除壞死外，還存在凋亡現(xiàn)象，細胞凋亡是造成腦缺血再灌

2、注后遲發(fā)性持續(xù)神經(jīng)細胞損傷不可忽視的重要因素。隨著研究的深入，凋亡在腦缺血再灌注損傷中的地位越來越明顯，其發(fā)展進程直接關(guān)系到腦損傷程度和梗死范圍，并影響患者的預后和功能恢復。 從我國國情看，當患者發(fā)生腦血管意外后送至醫(yī)院，待診斷明確，往往已失去溶栓治療的最佳時機，故缺血性腦血管病的治療成功率一直很低，缺血中心區(qū)的壞死發(fā)生較早，這部分腦組織的挽救相當困難。而隨著時間的延長，壞死已終止，凋亡仍在進行，故當前世界上對缺血性腦損害的防治

3、重點己從溶栓治療轉(zhuǎn)向?qū)θ毖氚祬^(qū)神經(jīng)元的缺血再灌注損傷的保護。另一方面，在危重病例的救治過程中，如心肺驟停復蘇后，嚴重休克糾正后，亦都存在著腦缺血再灌注的問題。 腦缺血再灌注損傷的機制是一個復雜的多因素過程，目前尚未完全闡明。近年來，國內(nèi)外學者在大量的實驗研究基礎(chǔ)上，提出了多種學說：如氧化應(yīng)激反應(yīng)學說，炎癥反應(yīng)，細胞因子學說，鈣超載學說，細胞凋亡學說以及興奮性氨基酸學說等。腦缺血再灌注過程中可產(chǎn)生大量的氧自由基，造成脂質(zhì)，蛋白質(zhì)

4、和核酸過氧化，細胞膜破壞，最終導致神經(jīng)元損傷。氧自由基尤其是超氧陰離子是局灶性腦缺血再灌注后細胞凋亡的主要因素。 醒腦靜注射液是我國著名中藥安宮牛黃丸的精制靜脈注射液。臨床上主要用于各種昏迷和腦血管意外病人，效果顯著。多位學者采用格拉斯哥昏迷積分，評價其對急性腦血管病意識障礙具有促醒作用，但其作用機制往往是沿用中醫(yī)理論解釋，限制了其使用范圍，尤其是難以向國外醫(yī)學界推廣。 我們推測，醒腦靜的這種臨床作用，是否能防止在腦缺血

5、再灌注損傷中占重要地位的凋亡進程，以及其能否抑制在腦缺血再灌注過程中引發(fā)的超乎尋常的過氧化反應(yīng)。為此，我們設(shè)計了該實驗，擬從通過觀察大鼠腦組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)活性的變化和神經(jīng)細胞凋亡率，探討醒腦靜注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷保護作用的機制。 研究目的：通過觀察大鼠腦組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量的變化和神經(jīng)細胞凋亡率，探討醒腦靜注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷保護作用的機

6、制。 研究方法：1、實驗動物和主要試劑：健康雄性SD大鼠100只，體重200～250g，由浙江大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。醒腦靜注射液，由無錫健宏藥業(yè)有限公司提供；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；凋亡檢測試劑盒由德國寶靈曼公司提供。 2、實驗方法：采用Longa線栓法制備大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型。隨機將100只SD雄性大鼠分為13組：假手術(shù)組4只，醒腦靜組和對照組分別為缺

7、血再灌注2、4、8、24、48、72小時各6組，每組8只。于缺血同時醒腦靜組大鼠給予腹腔注射醒腦靜注射液1mi/100g/day，對照組腹腔注射同等量的生理鹽水，假手術(shù)組其它操作同對照組，插線深度為10mm。 3、標本采集和檢測：每組于再灌注相應(yīng)的時間后快速斷頭處死，完整剝?nèi)∧X組織，其中每組的半數(shù)用于腦組織勻漿液的SOD、MDA檢測，另半數(shù)用于凋亡染色。SOD、MDA測定：所有腦組織勻漿液標本集中統(tǒng)一用黃嘌呤氧化酶法測定SOD；

8、用硫代巴比妥酸法測定MDA，嚴格按試劑盒操作步驟完成；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記(TUNEL)染色法檢測凋亡細胞。于缺血周邊區(qū)不重復隨機選取6個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算凋亡陽性細胞率(凋亡陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100％)。 4、統(tǒng)計學處理：實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間兩兩比較用t檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。 研究結(jié)果：實驗過程中，有6只大鼠考慮因麻醉意外死亡，補充6只進入實驗，最后

9、進入結(jié)果分析的大鼠為100只。 1、腦組織勻漿液SOD和MDA的變化：與假手術(shù)組相比，缺血再灌注后，醒腦靜組和對照組的腦組織勻漿液SOD活性明顯下降；MDA濃度顯著升高。醒腦靜組上述兩項指標的變化與對照組相比明顯減弱，有顯著性差異；動態(tài)觀察可見：SOD，MDA的改變從再灌注早期即出現(xiàn)，2小時即有明顯增高，隨著缺血再灌注時間的延長，這種改變更明顯，至24小時后出現(xiàn)回落。 2、凋亡染色檢測結(jié)果：缺血再灌注對側(cè)腦組織(左側(cè))和

10、假手術(shù)組腦片中未出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡；腦缺血再灌注后2小時內(nèi)亦未見有凋亡陽性細胞，于再灌注后4小時開始出現(xiàn)，凋亡細胞陽性率隨著再灌注時間的延長進行性增高，一直至72小時未見有下降趨勢；凋亡細胞主要分布在缺血半暗帶區(qū)，細胞縮小，變形，濃染，呈深藍色。使用醒腦靜后，醒腦靜組較相應(yīng)時相點對照組凋亡細胞減少，有顯著性差異。 結(jié)論：腦缺血再灌注能使體內(nèi)氧化系統(tǒng)被激活，腦組織中氧自由基水平升高，參與腦缺血再灌注損傷，神經(jīng)元凋亡是這種損傷的重要形式