牙周膜細(xì)胞膜片的構(gòu)建及脂肪干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的初步研究.pdf

1、牙周炎是一種慢性感染性疾病，可破壞結(jié)締組織基質(zhì)和細(xì)胞，導(dǎo)致牙槽骨吸收，最終導(dǎo)致牙齒缺失。目前對牙周炎的治療均無法恢復(fù)原始的牙周組織結(jié)構(gòu)。組織工程作為重建缺失組織，產(chǎn)生新生組織的技術(shù)，為實(shí)現(xiàn)牙周組織再生提供了新的思路和方法。
　　人牙周膜細(xì)胞(hPDLCs)具有多向分化潛能，可作為牙周組織工程的種子細(xì)胞之一。L-抗壞血酸-2-磷酸酯(L-AS-2-P)是抗壞血酸的衍生物，通過誘導(dǎo)I型膠原的合成，增加細(xì)胞外基質(zhì)的聚積促進(jìn)細(xì)胞膜片的形成

2、。細(xì)胞膜片克服了傳統(tǒng)支架空間體積大，降解的物質(zhì)對細(xì)胞毒性損傷的缺陷，僅依靠增加內(nèi)源性細(xì)胞外基質(zhì)而形成，在保證種子細(xì)胞活性的同時，還可增大細(xì)胞密度。但是單層細(xì)胞膜片內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的含量有限，易收縮，并且在轉(zhuǎn)移時需要借助承載系統(tǒng)，而承托材料在降解時所釋放的物質(zhì)又成為組織再生的不利因素。因此構(gòu)建操作性能強(qiáng)的膜片是亟待解決的問題。
　　組織工程產(chǎn)品長期存活，依賴于及時地建立血供。豐富血供不僅可為細(xì)胞提供營養(yǎng)，還可維持組織穩(wěn)態(tài)。而在組織工程產(chǎn)

3、品血管化發(fā)生過程中，內(nèi)皮細(xì)胞具有重要的作用。但是成體內(nèi)皮細(xì)胞取材不方便，且具有免疫抑制性。脂肪干細(xì)胞(ADSCs)可經(jīng)誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞，而且來源豐富且無免疫源性，可為組織工程血管化提供內(nèi)皮細(xì)胞來源。
　　目的：
　　1.構(gòu)建hPDLCs膜片三維聚合體和三層復(fù)合膜片
　　2.嘗試應(yīng)用內(nèi)皮培養(yǎng)基(EGM-2)體外誘導(dǎo)ADSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化，并構(gòu)建PDLCs-ECs-PDLCs的'三明治結(jié)構(gòu)復(fù)合膜片
　　方法：

4、r>　　1.單層膜片的制備
　　組織塊貼壁法原代培養(yǎng)牙周膜成纖維細(xì)胞，檢測骨橋蛋白，鑒定其成骨特性。按照不同濃度L-AS-2-P，不同初始接種密度將hPDLCs分組，根據(jù)形成膜片所需時間最短，膜片可操作性最強(qiáng)的原則，篩選出最適條件。
　　2.三維聚合體的制備
　　將刮下的單層hPDLCs膜片在最適培養(yǎng)條件下自然皺縮7d，獲得三維聚合體。觀察其操作性能的改變。并通過HE染色，觀察聚合體細(xì)胞密度、細(xì)胞外基質(zhì)的情況。

5、　　3.三層復(fù)合膜片的制備
　　在共聚焦培養(yǎng)皿中制備第一層hPDLCs膜片，在6孔板內(nèi)制備第二層和第三層細(xì)胞膜片，然后將6孔板內(nèi)的hPDLCs膜片依次轉(zhuǎn)移到共聚焦培養(yǎng)皿中的第一層膜片上。為觀察細(xì)胞膜片覆合后的狀況，在膜片轉(zhuǎn)移之前，應(yīng)用Hoechst33258熒光染料進(jìn)行細(xì)胞核的染色，分為兩種模式，一為對第一層和第三層細(xì)胞膜片進(jìn)行熒光染色，二為只對第二層膜片進(jìn)行染色。膜片覆合完成后即進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察并采集照片。
　　4.E

6、GM-2誘導(dǎo)ADSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化
　　皮下脂肪組織經(jīng)膠原酶消化后獲得脂肪間充質(zhì)細(xì)胞，通過誘導(dǎo)其向成骨、成脂細(xì)胞分化，鑒定其干細(xì)胞特性。繼而應(yīng)用EGM-2誘導(dǎo)其向內(nèi)皮細(xì)胞分化，分別在7d、14d進(jìn)行CD31免疫組化染色。
　　結(jié)果：
　　1.牙周膜細(xì)胞膜片三維聚合體呈球狀，質(zhì)韌，可隨意切割。HE染色顯示細(xì)胞密度較高，細(xì)胞之間有大量細(xì)胞外基質(zhì)。
　　2.三層復(fù)合膜片在共聚焦顯微鏡下觀察顯示，熒光細(xì)胞密度和亮度的漸