牙周膜細胞膜片的構建及脂肪干細胞向內皮細胞分化的初步研究.pdf

1、牙周炎是一種慢性感染性疾病，可破壞結締組織基質和細胞，導致牙槽骨吸收，最終導致牙齒缺失。目前對牙周炎的治療均無法恢復原始的牙周組織結構。組織工程作為重建缺失組織，產生新生組織的技術，為實現(xiàn)牙周組織再生提供了新的思路和方法。
　　人牙周膜細胞(hPDLCs)具有多向分化潛能，可作為牙周組織工程的種子細胞之一。L-抗壞血酸-2-磷酸酯(L-AS-2-P)是抗壞血酸的衍生物，通過誘導I型膠原的合成，增加細胞外基質的聚積促進細胞膜片的形成

2、。細胞膜片克服了傳統(tǒng)支架空間體積大，降解的物質對細胞毒性損傷的缺陷，僅依靠增加內源性細胞外基質而形成，在保證種子細胞活性的同時，還可增大細胞密度。但是單層細胞膜片內細胞外基質的含量有限，易收縮，并且在轉移時需要借助承載系統(tǒng)，而承托材料在降解時所釋放的物質又成為組織再生的不利因素。因此構建操作性能強的膜片是亟待解決的問題。
　　組織工程產品長期存活，依賴于及時地建立血供。豐富血供不僅可為細胞提供營養(yǎng)，還可維持組織穩(wěn)態(tài)。而在組織工程產

3、品血管化發(fā)生過程中，內皮細胞具有重要的作用。但是成體內皮細胞取材不方便，且具有免疫抑制性。脂肪干細胞(ADSCs)可經誘導分化為內皮細胞，而且來源豐富且無免疫源性，可為組織工程血管化提供內皮細胞來源。
　　目的：
　　1.構建hPDLCs膜片三維聚合體和三層復合膜片
　　2.嘗試應用內皮培養(yǎng)基(EGM-2)體外誘導ADSCs向內皮細胞分化，并構建PDLCs-ECs-PDLCs的'三明治結構復合膜片
　　方法：

4、r>　　1.單層膜片的制備
　　組織塊貼壁法原代培養(yǎng)牙周膜成纖維細胞，檢測骨橋蛋白，鑒定其成骨特性。按照不同濃度L-AS-2-P，不同初始接種密度將hPDLCs分組，根據形成膜片所需時間最短，膜片可操作性最強的原則，篩選出最適條件。
　　2.三維聚合體的制備
　　將刮下的單層hPDLCs膜片在最適培養(yǎng)條件下自然皺縮7d，獲得三維聚合體。觀察其操作性能的改變。并通過HE染色，觀察聚合體細胞密度、細胞外基質的情況。

5、　　3.三層復合膜片的制備
　　在共聚焦培養(yǎng)皿中制備第一層hPDLCs膜片，在6孔板內制備第二層和第三層細胞膜片，然后將6孔板內的hPDLCs膜片依次轉移到共聚焦培養(yǎng)皿中的第一層膜片上。為觀察細胞膜片覆合后的狀況，在膜片轉移之前，應用Hoechst33258熒光染料進行細胞核的染色，分為兩種模式，一為對第一層和第三層細胞膜片進行熒光染色，二為只對第二層膜片進行染色。膜片覆合完成后即進行共聚焦顯微鏡觀察并采集照片。
　　4.E

6、GM-2誘導ADSCs向內皮細胞分化
　　皮下脂肪組織經膠原酶消化后獲得脂肪間充質細胞，通過誘導其向成骨、成脂細胞分化，鑒定其干細胞特性。繼而應用EGM-2誘導其向內皮細胞分化，分別在7d、14d進行CD31免疫組化染色。
　　結果：
　　1.牙周膜細胞膜片三維聚合體呈球狀，質韌，可隨意切割。HE染色顯示細胞密度較高，細胞之間有大量細胞外基質。
　　2.三層復合膜片在共聚焦顯微鏡下觀察顯示，熒光細胞密度和亮度的漸