小鼠rDNA區(qū)靶向載體構(gòu)建及mESCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化研究.pdf

1、我室早期研究發(fā)現(xiàn)，核糖體基因(rDNA)區(qū)可能是安全有效的基因打靶位點(diǎn)。目前，我室已經(jīng)成功構(gòu)建多個(gè)人類核糖體基因區(qū)靶向載體，并且經(jīng)過打靶能定點(diǎn)整合不同的外源基因至多種細(xì)胞類型的rDNA區(qū)。近期還突破性獲得了定點(diǎn)整合外源基因FVⅢ和FⅨ并能長期穩(wěn)定表達(dá)的人胚胎干細(xì)胞株，為遺傳性疾病的基因治療提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。為推進(jìn)rDNA區(qū)打靶結(jié)合干細(xì)胞在基因治療臨床前的應(yīng)用，對該策略實(shí)施的安全性驗(yàn)證就顯得尤為重要。因此，我室擬打靶小鼠胚胎干細(xì)胞（mESC

2、s）的rDNA區(qū)，再通過將打靶后的mESCs發(fā)育為子代小鼠，從而觀測rDNA打靶是否對胚胎發(fā)育及成體各階段產(chǎn)生影響。在此方案指導(dǎo)下，本研究將針對mESCs的rDNA區(qū)設(shè)計(jì)并構(gòu)建打靶載體，再嘗試打靶mESCs，以獲得rDNA區(qū)定點(diǎn)整合外源基因的mESCs。同時(shí)，在本室利用干細(xì)胞進(jìn)行血友病基因治療的基礎(chǔ)上，本研究還將定向分化mESCs至內(nèi)皮細(xì)胞，為之后在小鼠體內(nèi)開展血友病的基因治療研究奠定基礎(chǔ)。
　　第一部分：小鼠核糖體基因區(qū)靶向載體

3、的構(gòu)建以及mESCs打靶研究。
　　目的：針對小鼠核糖體基因區(qū)+2527至+6875位點(diǎn)設(shè)計(jì)小鼠核糖體基因區(qū)靶向載體并初步驗(yàn)證其其打靶效率。
　　方法：⑴針對小鼠核糖體基因區(qū)位點(diǎn)從+2527位點(diǎn)至+6875位點(diǎn)設(shè)計(jì)同源臂。將此DNA片段分成兩部分?jǐn)U增，分別構(gòu)建成T-AR1與T-AR2載體，再利用酶切位點(diǎn)拼接成全長的同源臂，構(gòu)建成pMr載體。⑵分別擴(kuò)增Neo與GFP兩個(gè)篩選基因，通過酶切連接克隆至pMr同源臂中的EcoRⅠ位點(diǎn)

4、，并引入Cre-loxp系統(tǒng)中的loxp序列，從而構(gòu)建成小鼠rDNA區(qū)打靶載體pMrn及pMr-GFP。⑶分離MEF細(xì)胞作為mESCs滋養(yǎng)層細(xì)胞，并在LIF的作用下，建立穩(wěn)定的mESCs培養(yǎng)體系。⑷將pMrn打靶載體利用電穿孔技術(shù)打靶mESCs，利用“啟動(dòng)子陷阱”策略富集同源重組子，用G418對打靶細(xì)胞進(jìn)行篩選。
　　結(jié)果：①酶切以及測序鑒定結(jié)果表明成功構(gòu)建pMrn、pMr-GFP兩個(gè)小鼠rDNA區(qū)打靶載體;②在滋養(yǎng)層細(xì)胞及LIF

5、的維持下，mESCs細(xì)胞間致密，成典型克隆樣生長，邊界清晰，未見明顯的細(xì)胞，且堿性磷酸酶檢測成陽性;③pMrn通過電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)染單細(xì)胞化后mESCs，利用G418藥物篩選，大部分細(xì)胞脫落死亡，兩個(gè)星期后篩選出抗性克隆。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了含loxp位點(diǎn)的小鼠核糖體基因區(qū)靶向載體，打靶mESCs后能篩選到抗性克隆。
　　第二部分：體外mESCs向內(nèi)皮細(xì)胞定向分化技術(shù)。
　　目的：建立體外mESCs向內(nèi)皮細(xì)胞定向分化的技

6、術(shù)，為后續(xù)在小鼠體內(nèi)開展血友病的基因治療研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：⑴聯(lián)合VEGF生長因子利用EGM-2內(nèi)皮細(xì)胞分化培養(yǎng)基，再經(jīng)EB途徑誘導(dǎo)mESCs向內(nèi)皮細(xì)胞定向分化。⑵用RT-PCR檢測由mESCs細(xì)胞分化而來的內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志基因的表達(dá)情況。⑶利用流式分析鑒定內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：①mESCs在形成EB后，經(jīng)分化培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下，逐漸貼壁生長出單層細(xì)胞，2天后可觀察到部分克隆中出現(xiàn)鵝卵石樣的典型內(nèi)皮樣