利用SD大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外構(gòu)建成骨細(xì)胞膜片、血管內(nèi)皮細(xì)胞膜片的研究.pdf

1、目的：利用SD大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng),獲得具有成骨、成血管潛能的雙細(xì)胞膜片，為血管化組織工程骨的構(gòu)建提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　方法：取SD大鼠附睪及背側(cè)脂肪組織，0.1％Ⅰ型膠原酶消化分離獲得脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs），傳代培養(yǎng)以獲得較為純凈的ADSCs。流式細(xì)胞術(shù)鑒定其表面分子CD29、CD44、CD31、CD45的表達(dá)；分別向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，油紅O、茜素紅、阿利新藍(lán)染色定性檢測

2、其多項(xiàng)分化能力。將ADSCs以1x106/cm2密度接種，用成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（含50μg/ml抗壞血酸）持續(xù)培養(yǎng)，觀察膜片的形成過程和形成情況，將獲得的細(xì)胞膜片行SEM、TEM、H&E及vonkossa染色檢測其成骨性能。利用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（EGM-2）（含50ng/ml VEGF）將ADSCs體外向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)14-21天后，流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面分子CD44、CD29、CD31、CD34；Matrigel基質(zhì)膠檢測內(nèi)皮細(xì)

3、胞體外成血管功能。將ADSCs以1x106/cm2密度接種，用EGM-2培養(yǎng)基（含50μg/ml抗壞血酸和50ng/ml VEGF）持續(xù)培養(yǎng)，觀察膜片的形成過程和形成情況，將獲得的細(xì)胞膜片行H&E染色、TEM及免疫熒光CD31染色檢測其成血管性能。
　　結(jié)果：原代ADSCs呈短梭形及多角形,培養(yǎng)3代后，細(xì)胞呈均一的長梭形。流式細(xì)胞術(shù)鑒定顯示ADSCs高度表達(dá)CD29、CD44,基本不表達(dá)CD31、CD34。將ADSCs分別向脂肪細(xì)

4、胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，染色定性檢測顯示油紅O染色陽性；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，alp）alp染色、茜素紅染色、vonkossa硝酸銀染色陽性；阿利新藍(lán)染色陽性。ADSCs以高密度（1×106/cm2）接種于成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（含50μg/ml抗壞血酸）中持續(xù)培養(yǎng)，14天后可成功獲得細(xì)胞膜片。H&E染色見膜片由大量成骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成；掃描電鏡顯示細(xì)胞被自己所分泌的細(xì)胞外基質(zhì)包埋，基質(zhì)中可見大

5、量礦化結(jié)節(jié)聚集；透射電鏡顯示細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)針狀鈣鹽結(jié)晶沉積；Vonkossa硝酸銀染色陽性，這些結(jié)果均表明該膜片具有潛在的成骨能力。ADSCs以高密度（1×106/cm2）接種于EGM-2培養(yǎng)基（含50μg/ml抗壞血酸、50ng/ml VEGF）中持續(xù)培養(yǎng)，16天后可成功獲得細(xì)胞膜片。H&E染色可見膜片由大量內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成；透射電鏡顯示細(xì)胞內(nèi)可見內(nèi)皮細(xì)胞特殊結(jié)構(gòu)Weibel-Palade小體；免疫熒光CD31染色陽性，這些均表

6、明該膜片具有潛在的成血管能力。
　　結(jié)論：1.大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可以定向分化為成骨細(xì)胞，高濃度持續(xù)成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后可獲得細(xì)胞膜片，且該膜片可能具有潛在的成骨能力。
　　2.大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可以定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞，高濃度持續(xù)成內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后可獲得細(xì)胞膜片，且該膜片可能具有潛在的成血管 能力。
　　3.分別獲取脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的具有成骨能力的細(xì)胞膜片及成血管能力的細(xì)胞膜片，為血管化組織工程骨的構(gòu)建奠定一定的