大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展缺血性心臟病的患病率和死亡率也逐年提高，在一些較為發(fā)達(dá)的地區(qū)居民死亡的首位原因。缺血性心臟病的基本病理學(xué)改變?cè)谟诰植啃募〗M織的血管狹窄閉塞，導(dǎo)致該處血液灌注減少甚至喪失在。常規(guī)治療方法如經(jīng)皮動(dòng)脈腔內(nèi)介入治療和旁路移植術(shù)均只能解決內(nèi)徑>2mm的血管的病變，而對(duì)內(nèi)徑<2mm的血管和彌漫性病變及在無流出道而無法進(jìn)行旁路手術(shù)的情況基本無能為力。并且經(jīng)皮動(dòng)脈腔內(nèi)介入治療和旁路移植術(shù)等目前治療缺血性心肌病的重要手段，均可促進(jìn)血管

2、內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells， ECs）的凋亡和損傷引起ECs功能失調(diào)和（或）結(jié)構(gòu)損害，促使血管受損后內(nèi)膜增生性病變的形成和血管再狹窄的發(fā)生。
　　 隨著干細(xì)胞研究和細(xì)胞移植技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞移植療法有望成為治療心血管疾病的新策略。目前，臍帶血和骨髓是出生后內(nèi)皮祖細(xì)胞的主要來源。和骨髓一樣，脂肪組織中也存在容易獲取的間質(zhì)細(xì)胞，脂肪組織由中胚層發(fā)育而來，研究表明中胚層的一些誘導(dǎo)因子參與胚體發(fā)育和造血分化[4-5]。胚

3、胎干細(xì)胞體外分化研究也表明中胚層細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育過程中起重要作用[6]。
　　 2001年以來，國內(nèi)外多名科研人員陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，在脂肪組織中分離得到的基質(zhì)血管成分（stromalvascular fraction，SVF）中，存在著一些與骨髓MSCs相似的具有多向分化能力的干細(xì)胞，分別命名為脂肪提取細(xì)胞（processed lipoaspirate cells，PLA細(xì)胞）[7-8]，基質(zhì)血管成分細(xì)胞（stromal-vascul

4、ar fraction cells，SVF）[9]，脂肪組織源性基質(zhì)細(xì)胞（adipo-setissue deftved stromal cells，ATSCs）[10]，脂肪源性中胚層干細(xì)胞（adipose-derived mesodermal stem cell，ADMSCs）[11]，或者脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞（fat-deftved mesenchymal stem cells， FDMSCs）[12]。因?yàn)樗鼈兙憩F(xiàn)出可在體外大量

5、擴(kuò)增和多向分化的能力，根據(jù)國內(nèi)外研究結(jié)果，將其統(tǒng)稱為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose mesenchymal stem cells，AMSCs）。
　　 本試驗(yàn)旨在研究體外定向誘導(dǎo)大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（AMSCs）向血管內(nèi)皮細(xì)胞（VECs）分化的潛能與條件，為臨床心血管疾病的細(xì)胞療法和血管組織工程學(xué)的研究及應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 實(shí)驗(yàn)于2007年9月至2008年12月于河北醫(yī)科大學(xué)病理科實(shí)驗(yàn)室完成

6、。
　　 1.大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離，培養(yǎng)及體外誘導(dǎo)
　　 采用密度梯度離心法從Wistar雄性3周齡大鼠脂肪組織中分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞并在DMEM/F12完全培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。觀察其細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)特性。在細(xì)胞生長(zhǎng)至瓶底90％融合時(shí)用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA1：1消化，充分吹打形成單細(xì)胞懸濁液，按1：3比例傳代培養(yǎng)。選取生長(zhǎng)良好的第三代細(xì)胞，以血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vEGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IG

7、F-1）誘導(dǎo)其分化。其余細(xì)胞繼續(xù)在DMEM/F12完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)相同天數(shù)作為：RT-PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)的對(duì)照組。
　　 2.誘后細(xì)胞的分化鑒定
　　 觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)特性，并應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemical，ICC）檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志。研究AMSCs體外內(nèi)皮化的潛能與條件。
　　 結(jié)果：
　　 1.大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離，培養(yǎng)

8、及體外誘導(dǎo)
　　 （1）應(yīng)用密度梯度離心法分離的AMSCs純度較高，體外培養(yǎng)的均一性較好。
　　 （2）原代細(xì)胞接種后4h開始貼壁，其培養(yǎng)無需刺激因子。原代和傳代細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，成漩渦樣生長(zhǎng)。
　　 （3）傳代細(xì)胞變成圓形，傳代接種后6-8小時(shí)貼壁，而后逐漸伸展開，形態(tài)主要為梭形。
　　 （4） VEGF（50ng/ml）加IGF-1（20ng/ml）為誘導(dǎo)AMSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化比較合適的濃度。

9、>　　 2.誘后細(xì)胞的分化鑒定
　　 （1） RT-PCR顯示AMSCs誘導(dǎo)前CD31表達(dá)為陰性，誘導(dǎo)后陽性表達(dá)。
　　 （2）免疫細(xì)胞化學(xué)顯示AMSCs誘導(dǎo)前Ⅷ因子表達(dá)為陰性，誘導(dǎo)后部分細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)，部分弱陽性。陽性表達(dá)率為（62.22±3.59）％，與正常對(duì)照組相比Ⅷ因子相關(guān)抗原蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.密度梯度離心法是一種簡(jiǎn)單，有效分離AMSCs的方法。
　

10、　 2.VEGF（50ng/ml）加IGF-1（20ng/ml）為誘導(dǎo)AMSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化比較合適的濃度。
　　 3.體外培養(yǎng)的AMSCs具有向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能，可以用于血管新生的細(xì)胞治療。
　　 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離，培養(yǎng)，體外誘導(dǎo)及誘導(dǎo)后的分化方面進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示體外培養(yǎng)的AMSCs具有向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能，是臨床細(xì)胞移植治療心血管疾病一個(gè)值得關(guān)注的的新觀點(diǎn)。但本實(shí)驗(yàn)僅