延邊黃牛體細(xì)胞克隆卵母細(xì)胞顯微操作方法的研究.pdf

1、試驗(yàn)?zāi)康模阂匝舆咟S牛為研究對(duì)象，探求一種操作簡(jiǎn)便、低損傷、去核準(zhǔn)確的去核方法，同時(shí)確立一種適合延邊黃牛體細(xì)胞克隆的卵母細(xì)胞注核方法，從而為體細(xì)胞克隆整體效率的提高打下基礎(chǔ)。 試驗(yàn)方法：通過兩種不同的卵母細(xì)胞去核方法的去核比較，試驗(yàn)結(jié)果以操作時(shí)間效率、卵裂率和發(fā)育率來評(píng)定，從而驗(yàn)證擠壓法的可靠性和可行性。同時(shí)對(duì)使用此去核方法的去核最佳時(shí)間、最佳去除細(xì)胞質(zhì)數(shù)量以及確立最佳的注核方法進(jìn)行研究。 試驗(yàn)結(jié)果： 1．在兩種不

2、同去核方法的比較試驗(yàn)中，將Willadsen去核法進(jìn)行了改進(jìn)——擠壓法，無論在去核操作時(shí)間上(41s/枚)，還是在去核效率(80.70％)上都顯著地優(yōu)于盲吸法(76s/枚、65.00％，P<0.05)；此外，使用盲吸法去核的卵母細(xì)胞卵裂率為44.15％，而擠壓法(改進(jìn)的Willadsen法)的卵裂率為51.40％，兩者之間差異不顯著(P>0.05)，從而創(chuàng)立出一種較適合延邊黃牛體細(xì)胞克隆的去核方法——擠壓法。 2．為了進(jìn)一步確定

3、擠壓法的最佳去核時(shí)間，通過Hoechst33342染色、熒光顯微鏡的觀察，試驗(yàn)結(jié)果顯示，延邊黃牛卵母細(xì)胞隨體外成熟培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，核與極體之間距離有變大的趨勢(shì)。這就使以極體為標(biāo)志去核率隨成熟培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。本試驗(yàn)確定出適合擠壓法的最佳去核時(shí)間為20～22h。 3．在確定去除細(xì)胞質(zhì)數(shù)量的試驗(yàn)中，去除細(xì)胞質(zhì)數(shù)量為1/3和1/4(82.54％和81.05％)時(shí)的去核率顯著高于去除1/5組(64.75％)，試驗(yàn)結(jié)果看出隨著去除細(xì)胞

4、質(zhì)數(shù)量的增多，去核率有增高的趨勢(shì)，但對(duì)重組胚的后期發(fā)育不利，由表8可以確定去除最佳數(shù)量的細(xì)胞質(zhì)為總量的1/4～1/3；而在卵母細(xì)胞去除不同的細(xì)胞質(zhì)數(shù)量對(duì)重組胚卵裂率、發(fā)育率的影響試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與另兩組相比，去除1/4細(xì)胞質(zhì)組的卵裂率、4-Cell發(fā)育率是最高的，分別為41.68％、70.32％(P<0.05)。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，從而確立去除1/4總量的細(xì)胞質(zhì)是最佳的。 4．在研究卵母細(xì)胞注核方法試驗(yàn)中，電融合法注核與細(xì)胞

5、漿內(nèi)注射法相比，在注核顯微操作時(shí)間效率、卵裂率、4-Cell發(fā)育率上，電融合法組分別為53s/枚，43.65％，56.39％(P<0.05)，與細(xì)胞漿內(nèi)注射法組(77s/枚，18.69％，17.50％)之間存在顯著差異(P<0.05)，從而確定電融合法是一種適合延邊黃牛體細(xì)胞克隆的有效注核方法。 5．在試驗(yàn)六中，由試驗(yàn)結(jié)果顯示注核操作液中添加0.1％PVA對(duì)核移植卵裂率、發(fā)育率與對(duì)照組相比(49.34％，63.16％和52.14