延邊黃牛體細胞克隆胚胎氧化損傷的研究.pdf

1、延邊黃牛作為我國五大地方良種牛之一，其肉質(zhì)細嫩，營養(yǎng)豐富，具有優(yōu)秀的肉用潛能和廣闊的產(chǎn)品商業(yè)化發(fā)展前景，隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展和吉林省“東黃西紅”肉牛發(fā)展戰(zhàn)略的實施，延邊黃牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展越來越快，擴大產(chǎn)業(yè)化規(guī)模和提高科技附加值已經(jīng)成為當前延邊黃牛肉用發(fā)展的一個必要途徑。體細胞克隆技術作為一種新興的科技手段，不僅能夠作為胚胎干細胞技術、轉(zhuǎn)基因技術和醫(yī)學等科學研究的技術支撐，同時在畜牧業(yè)上可以用來生產(chǎn)大量具有相同基因型的家畜，在家畜育種、保種上

2、具有深遠的意義，但是目前為止的研究表明，該項技術存在效率低、生產(chǎn)的后代多有生理缺陷等情況，還不能夠達到生產(chǎn)實際的需要。在體外受精、人工授精、胚胎移植等繁殖生物技術中，研究配子在體外生產(chǎn)或體外保存過程中所受的氧化損傷，在體細胞克隆技術中研究顯微操作方法、融合激活方法、核質(zhì)重組（核重編程）機制、DNA甲基化等方面已有大量報道，研究體細胞克隆后代生理缺陷的分子機制已經(jīng)成為新的熱點，但是關于體細胞克隆胚胎的氧化損傷研究尚未見報道。
　　目

3、的：（1）觀察氧化劑過氧化氫（H2O2）對延邊黃牛體細胞克隆胚胎體外發(fā)育的影響，探討過氧化氫對其氧化損傷的作用；（2）觀察抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）對延邊黃牛體細胞克隆胚胎體外發(fā)育的影響，探討谷胱甘肽對其氧化損傷的保護作用；（3）以孤雌激活胚胎為對照，檢測延邊黃牛體細胞克隆胚胎內(nèi)部H2O2和超氧陰離子（O2·－）兩種活性氧（ROS）的含量，探討其在延邊黃牛體細胞克隆胚胎體外發(fā)育不同階段的變化規(guī)律；（4）以孤雌激活胚胎為對照，檢測延邊黃牛

4、體細胞克隆胚胎不同發(fā)育階段編碼過氧化氫酶（CAT）、含錳的超氧化物酶（Mn-SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的mRNA表達水平，探討其與氧化損傷程度之間的關系。
　　方法與內(nèi)容：（1）在體外培養(yǎng)液中添加外源性H2O2，觀察延邊黃牛體細胞克隆胚胎體外發(fā)育效率、發(fā)育速度以及氧化損傷帶來的質(zhì)量影響，確定H2O2影響其發(fā)育的臨界濃度、影響最大的時間；（2）在體外培養(yǎng)液中添加外源性GSH，觀察延邊黃牛體細胞克隆胚胎體外發(fā)育效率，確定緩

5、解氧化損傷所需添加的適宜濃度及適宜時間；（3）使用二氫乙錠和2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯分別對延邊黃牛體細胞克隆胚胎內(nèi)部的H2O2和O2·－進行染色，使用熒光顯微鏡觀察照相，利用圖像處理軟件進行量化分析，測定體細胞克隆胚胎不同發(fā)育時期的ROS含量，探求體細胞克隆胚胎內(nèi)部活性氧的變化規(guī)律；（4）使用特異引物，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應擴增延邊黃牛體細胞克隆胚胎編碼CAT、Mn-SOD和GPx的mRNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其表達結(jié)果，

6、同時使用凝膠圖像分析軟件進行半定量分析，確定其在延邊黃牛體細胞克隆胚胎體外不同發(fā)育階段的表達規(guī)律。
　　結(jié)果：（1）添加0μMol/L、60μMol/L、80μMol/LH2O2時卵裂率顯著高于100μMol/L和120μMol/L組（P<0.05），所有添加H2O2的處理組囊胚發(fā)育率顯著低于未添加的處理組（P<0.05）；0～24h添加 H2O2的處理組卵裂率顯著高于其它組（P<0.05），48～72h組16細胞以上發(fā)育率顯著低

7、于其它處理組（P<0.05）；不同時期不添加H2O2對延邊黃牛重組胚卵裂率沒有顯著影響（P>0.05），但是不同時期不添加H2O2時所有處理組16細胞以上發(fā)育率顯著低于對照組（所有時期不添加，P<0.05）；經(jīng)過H2O2處理后的重組胚卵裂球表面粗糙，胞質(zhì)不均勻，少且疏松，偶爾能見到極少或沒有胞質(zhì)的卵裂球，卵裂球與透明帶之間的間隙較大，發(fā)育不規(guī)則，卵裂球大小不一，相差較大，存在大量細胞碎片。（2）添加外源性GSH時，1 mMol/L組卵裂

8、率顯著高于7 mMol/L組（P<0.05），1 mMol/L和7 mMol/L組卵裂率與0 mMol/L和4 mMol/L組差異不顯著（P>0.05），1 mMol/L組囊胚發(fā)育率顯著高于0 mMol/L、4 mMol/L和7 mMol/L組（P<0.05）；不同時間添加GSH時，0～24 h組和24～48 h組卵裂率顯著高于對照組、48～72 h組和72～96h組（P<0.05），16細胞以上發(fā)育率與其它組差異不顯著（P>0.05）

9、，對照組16細胞以上發(fā)育率顯著低于48～72 h組和72～96h組（P<0.05）。（3）2細胞期孤雌激活與體細胞克隆組間O2·－水平差異不顯著（P>0.05），4細胞期、8細胞期、16細胞期和囊胚期體細胞克隆組均顯著高于孤雌激活組（P<0.05），延邊黃牛孤雌激活胚胎 O2·－變化以2細胞期最高，4細胞期最低，8細胞期有所上升，但低于2細胞期水平，16細胞期下降，囊胚期又再升高。延邊黃牛體細胞克隆胚胎O2·－變化以2細胞期最低，4細胞

10、期急速上升，8細胞期降低，16細胞期開始上升，至囊胚期基本持平；各細胞期體細胞克隆胚胎H2O2水平均顯著高于孤雌激活胚胎（P<0.05），延邊黃牛孤雌激活胚胎H2O2變化為2細胞期至囊胚期持續(xù)升高，延邊黃牛體細胞克隆胚胎H2O2變化以2細胞期最低，4細胞期急速上升，8細胞期降低后至囊胚期持續(xù)上升。（4）卵母細胞時期編碼CAT、Mn-SOD和GPx的基因均無表達，2細胞時期體細胞克隆胚胎編碼CAT的基因有表達，4細胞時期體細胞克隆胚胎編碼

11、CAT和GPx的基因有表達，孤雌激活胚胎編碼CAT的基因有表達，8細胞時期和16細胞以上時期體細胞克隆和孤雌激活胚胎編碼 CAT、Mn-SOD和GPx的基因均有表達；延邊黃牛核移植和孤雌激活胚胎編碼CAT的基因表達豐度之間在2細胞期以上均存在顯著差異（P<0.05），延邊黃牛核移植和孤雌激活胚胎編碼 Mn-SOD的基因表達豐度之間在8細胞期差異不顯著（P>0.05），16細胞期以上時期差異顯著（P<0.05），延邊黃牛核移植和孤雌激活胚

12、胎編碼GPx的基因表達豐度之間在4細胞期差異顯著（P<0.05），8細胞期以上時期差異不顯著（P<0.05）。
　　結(jié)論：（1）H2O2對延邊黃牛體細胞克隆胚胎具有氧化損傷及加快體外發(fā)育速度的作用，GSH對延邊黃牛體細胞克隆胚胎具有抗氧化保護作用；（2）延邊黃牛體細胞克隆胚胎所受的氧化應激致使其氧化損傷水平高于孤雌激活胚胎，其內(nèi)部ROS變化較大的時期正處于染色體基因組開始激活的時期；（3）延邊黃牛體細胞克隆胚胎編碼CAT、Mn-S