延邊黃牛體細(xì)胞克隆胚胎氧化損傷的研究.pdf

1、延邊黃牛作為我國(guó)五大地方良種牛之一，其肉質(zhì)細(xì)嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有優(yōu)秀的肉用潛能和廣闊的產(chǎn)品商業(yè)化發(fā)展前景，隨著我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展和吉林省“東黃西紅”肉牛發(fā)展戰(zhàn)略的實(shí)施，延邊黃牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展越來(lái)越快，擴(kuò)大產(chǎn)業(yè)化規(guī)模和提高科技附加值已經(jīng)成為當(dāng)前延邊黃牛肉用發(fā)展的一個(gè)必要途徑。體細(xì)胞克隆技術(shù)作為一種新興的科技手段，不僅能夠作為胚胎干細(xì)胞技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)和醫(yī)學(xué)等科學(xué)研究的技術(shù)支撐，同時(shí)在畜牧業(yè)上可以用來(lái)生產(chǎn)大量具有相同基因型的家畜，在家畜育種、保種上

2、具有深遠(yuǎn)的意義，但是目前為止的研究表明，該項(xiàng)技術(shù)存在效率低、生產(chǎn)的后代多有生理缺陷等情況，還不能夠達(dá)到生產(chǎn)實(shí)際的需要。在體外受精、人工授精、胚胎移植等繁殖生物技術(shù)中，研究配子在體外生產(chǎn)或體外保存過(guò)程中所受的氧化損傷，在體細(xì)胞克隆技術(shù)中研究顯微操作方法、融合激活方法、核質(zhì)重組（核重編程）機(jī)制、DNA甲基化等方面已有大量報(bào)道，研究體細(xì)胞克隆后代生理缺陷的分子機(jī)制已經(jīng)成為新的熱點(diǎn)，但是關(guān)于體細(xì)胞克隆胚胎的氧化損傷研究尚未見報(bào)道。
　　目

3、的：（1）觀察氧化劑過(guò)氧化氫（H2O2）對(duì)延邊黃牛體細(xì)胞克隆胚胎體外發(fā)育的影響，探討過(guò)氧化氫對(duì)其氧化損傷的作用；（2）觀察抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）對(duì)延邊黃牛體細(xì)胞克隆胚胎體外發(fā)育的影響，探討谷胱甘肽對(duì)其氧化損傷的保護(hù)作用；（3）以孤雌激活胚胎為對(duì)照，檢測(cè)延邊黃牛體細(xì)胞克隆胚胎內(nèi)部H2O2和超氧陰離子（O2·－）兩種活性氧（ROS）的含量，探討其在延邊黃牛體細(xì)胞克隆胚胎體外發(fā)育不同階段的變化規(guī)律；（4）以孤雌激活胚胎為對(duì)照，檢測(cè)延邊黃牛

4、體細(xì)胞克隆胚胎不同發(fā)育階段編碼過(guò)氧化氫酶（CAT）、含錳的超氧化物酶（Mn-SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）的mRNA表達(dá)水平，探討其與氧化損傷程度之間的關(guān)系。
　　方法與內(nèi)容：（1）在體外培養(yǎng)液中添加外源性H2O2，觀察延邊黃牛體細(xì)胞克隆胚胎體外發(fā)育效率、發(fā)育速度以及氧化損傷帶來(lái)的質(zhì)量影響，確定H2O2影響其發(fā)育的臨界濃度、影響最大的時(shí)間；（2）在體外培養(yǎng)液中添加外源性GSH，觀察延邊黃牛體細(xì)胞克隆胚胎體外發(fā)育效率，確定緩

5、解氧化損傷所需添加的適宜濃度及適宜時(shí)間；（3）使用二氫乙錠和2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯分別對(duì)延邊黃牛體細(xì)胞克隆胚胎內(nèi)部的H2O2和O2·－進(jìn)行染色，使用熒光顯微鏡觀察照相，利用圖像處理軟件進(jìn)行量化分析，測(cè)定體細(xì)胞克隆胚胎不同發(fā)育時(shí)期的ROS含量，探求體細(xì)胞克隆胚胎內(nèi)部活性氧的變化規(guī)律；（4）使用特異引物，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增延邊黃牛體細(xì)胞克隆胚胎編碼CAT、Mn-SOD和GPx的mRNA，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其表達(dá)結(jié)果，

6、同時(shí)使用凝膠圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，確定其在延邊黃牛體細(xì)胞克隆胚胎體外不同發(fā)育階段的表達(dá)規(guī)律。
　　結(jié)果：（1）添加0μMol/L、60μMol/L、80μMol/LH2O2時(shí)卵裂率顯著高于100μMol/L和120μMol/L組（P<0.05），所有添加H2O2的處理組囊胚發(fā)育率顯著低于未添加的處理組（P<0.05）；0～24h添加 H2O2的處理組卵裂率顯著高于其它組（P<0.05），48～72h組16細(xì)胞以上發(fā)育率顯著低

7、于其它處理組（P<0.05）；不同時(shí)期不添加H2O2對(duì)延邊黃牛重組胚卵裂率沒有顯著影響（P>0.05），但是不同時(shí)期不添加H2O2時(shí)所有處理組16細(xì)胞以上發(fā)育率顯著低于對(duì)照組（所有時(shí)期不添加，P<0.05）；經(jīng)過(guò)H2O2處理后的重組胚卵裂球表面粗糙，胞質(zhì)不均勻，少且疏松，偶爾能見到極少或沒有胞質(zhì)的卵裂球，卵裂球與透明帶之間的間隙較大，發(fā)育不規(guī)則，卵裂球大小不一，相差較大，存在大量細(xì)胞碎片。（2）添加外源性GSH時(shí)，1 mMol/L組卵裂

8、率顯著高于7 mMol/L組（P<0.05），1 mMol/L和7 mMol/L組卵裂率與0 mMol/L和4 mMol/L組差異不顯著（P>0.05），1 mMol/L組囊胚發(fā)育率顯著高于0 mMol/L、4 mMol/L和7 mMol/L組（P<0.05）；不同時(shí)間添加GSH時(shí)，0～24 h組和24～48 h組卵裂率顯著高于對(duì)照組、48～72 h組和72～96h組（P<0.05），16細(xì)胞以上發(fā)育率與其它組差異不顯著（P>0.05）

9、，對(duì)照組16細(xì)胞以上發(fā)育率顯著低于48～72 h組和72～96h組（P<0.05）。（3）2細(xì)胞期孤雌激活與體細(xì)胞克隆組間O2·－水平差異不顯著（P>0.05），4細(xì)胞期、8細(xì)胞期、16細(xì)胞期和囊胚期體細(xì)胞克隆組均顯著高于孤雌激活組（P<0.05），延邊黃牛孤雌激活胚胎 O2·－變化以2細(xì)胞期最高，4細(xì)胞期最低，8細(xì)胞期有所上升，但低于2細(xì)胞期水平，16細(xì)胞期下降，囊胚期又再升高。延邊黃牛體細(xì)胞克隆胚胎O2·－變化以2細(xì)胞期最低，4細(xì)胞

10、期急速上升，8細(xì)胞期降低，16細(xì)胞期開始上升，至囊胚期基本持平；各細(xì)胞期體細(xì)胞克隆胚胎H2O2水平均顯著高于孤雌激活胚胎（P<0.05），延邊黃牛孤雌激活胚胎H2O2變化為2細(xì)胞期至囊胚期持續(xù)升高，延邊黃牛體細(xì)胞克隆胚胎H2O2變化以2細(xì)胞期最低，4細(xì)胞期急速上升，8細(xì)胞期降低后至囊胚期持續(xù)上升。（4）卵母細(xì)胞時(shí)期編碼CAT、Mn-SOD和GPx的基因均無(wú)表達(dá)，2細(xì)胞時(shí)期體細(xì)胞克隆胚胎編碼CAT的基因有表達(dá)，4細(xì)胞時(shí)期體細(xì)胞克隆胚胎編碼

11、CAT和GPx的基因有表達(dá)，孤雌激活胚胎編碼CAT的基因有表達(dá)，8細(xì)胞時(shí)期和16細(xì)胞以上時(shí)期體細(xì)胞克隆和孤雌激活胚胎編碼 CAT、Mn-SOD和GPx的基因均有表達(dá)；延邊黃牛核移植和孤雌激活胚胎編碼CAT的基因表達(dá)豐度之間在2細(xì)胞期以上均存在顯著差異（P<0.05），延邊黃牛核移植和孤雌激活胚胎編碼 Mn-SOD的基因表達(dá)豐度之間在8細(xì)胞期差異不顯著（P>0.05），16細(xì)胞期以上時(shí)期差異顯著（P<0.05），延邊黃牛核移植和孤雌激活胚

12、胎編碼GPx的基因表達(dá)豐度之間在4細(xì)胞期差異顯著（P<0.05），8細(xì)胞期以上時(shí)期差異不顯著（P<0.05）。
　　結(jié)論：（1）H2O2對(duì)延邊黃牛體細(xì)胞克隆胚胎具有氧化損傷及加快體外發(fā)育速度的作用，GSH對(duì)延邊黃牛體細(xì)胞克隆胚胎具有抗氧化保護(hù)作用；（2）延邊黃牛體細(xì)胞克隆胚胎所受的氧化應(yīng)激致使其氧化損傷水平高于孤雌激活胚胎，其內(nèi)部ROS變化較大的時(shí)期正處于染色體基因組開始激活的時(shí)期；（3）延邊黃牛體細(xì)胞克隆胚胎編碼CAT、Mn-S