牛卵母細胞冷凍方法的研究.pdf

1、為研究封閉式拉長細管（closed pulled straw,CPS）能否用于冷凍牛卵母細胞。本試驗分別探討了表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）對牛卵母細胞體外成熟及共培養(yǎng)方式對胚胎發(fā)育的影響、最佳卵母細胞玻璃化冷凍液的選擇、不同發(fā)育階段對牛卵母細胞玻璃化冷凍的影響和CPS冷凍牛卵母細胞的研究。研究結(jié)果如下：
　　1分別將牛卵母細胞用含有不同濃度 EGF的成熟液進行成熟培養(yǎng)，并根據(jù)成熟率分析E

2、GF的最適濃度；將受精胚胎用不同的共培養(yǎng)體系進行培養(yǎng)，根據(jù)胚胎發(fā)育率分析兩種共培養(yǎng)體系對胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果表明，EGF含量為15和20 ng/mL兩組的發(fā)育率顯著高于其他幾個組（P<0.05）；兩種共培養(yǎng)體系中的胚胎發(fā)育率無顯著差異（P>0.05）。結(jié)論：牛卵母細胞成熟培養(yǎng)時，當(dāng)培養(yǎng)液中 EGF含量為15-20 ng/mL時成熟效果可達到最好；顆粒細胞和成纖維細胞兩種共培養(yǎng)方法對胚胎發(fā)育的影響無顯著差異。因此，試驗中可以根據(jù)實際條件來

3、選擇不同種類的細胞來進行共培養(yǎng)。
　　2將成熟牛卵母細胞分別用四種冷凍液進行冷凍，解凍后進行體外受精，并根據(jù)胚胎發(fā)育率確定最佳冷凍液。結(jié)果表明，冷凍液濃度為20％EG+20%DMSO組的胚胎發(fā)育率顯著高于其它幾個組（P<0.05）。結(jié)論：將20%的EG和20%的DMSO共同使用，做為冷凍保護劑加入到玻璃化冷凍液中，可以使冷凍效果達到最佳。
　　3將牛卵母細胞分別成熟培養(yǎng)不同的時間后進行冷凍，解凍后培養(yǎng)至成熟并進行體外受精，根

4、據(jù)胚胎發(fā)育率確定牛卵母細胞最佳冷凍時期。成熟培養(yǎng)22h的牛卵母細胞玻璃化冷凍，解凍并體外受精后其成熟率、卵裂率和囊胚率分別為77.2%、56.5%和16.9%，顯著高于其他幾個成熟時期的牛卵母細胞發(fā)育率。結(jié)論：牛卵母細胞體外培養(yǎng)22h時，其生理狀況基本達到成熟，并且受精前需在成熟液中繼續(xù)培養(yǎng)2h，有利于冷凍保護劑的充分脫出，玻璃化冷凍的效果更好。
　　4將GV期牛卵母細胞分別采用細管、開放式拉長細管（open pulled str

5、aw,OPS）和CPS三種方法進行冷凍，解凍后進行體外成熟和體外受精，根據(jù)胚胎發(fā)育率對比三種方法的差異。結(jié)果表明：細管組、OPS組和CPS組卵母細胞的正常形態(tài)率分別為67.1%、88.1%和85.8%，成熟率分別為49.1%、66.9%和64.4%，卵裂率分別為19.6%、45.8%和43.4%，囊胚率分別為0、6.6%和6.0%，OPS和CPS兩組間上述指標(biāo)差異均不顯著（P>0.05），但均高于細管組，且差異極顯著（P<0.01）。結(jié)