延邊黃牛體細胞克隆融合、激活條件的研究.pdf

1、面對愈來愈激烈的國際市場競爭形勢，我國牛的品種還基本處于役用型或役肉兼用型和役乳兼用型的現(xiàn)狀，這就決定了我國的牛產品很難在國際舞臺上占有一席之地。進入21世紀以來，人們越來越感受到改良我國現(xiàn)有牛品種的迫切性，于是人們將視線轉移到作為選種選育的一項高效新興技術——體細胞克隆技術上來。 延邊黃牛作為我國五大地方良種牛之一，具有不可多得的肉用品質，極具國際市場潛力，近年來它的保種選育工作要求越來越大的科技投入，為了加快其改良進程，提高

2、選種選育效率，我們引入了體細胞克隆技術，為了這項工作的順利開展，對其技術路線中的關鍵環(huán)節(jié)一融合、激活作預先一步的研究，從而保障該技術在延邊黃牛保種選育工作中的成功應用。 本研究以新鮮的顆粒細胞作為供核細胞，以延邊黃牛M Ⅱ期去核的卵母細胞作為受體，以擠壓法去核，注入供體顆粒細胞到卵黃周隙中，甘露醇融合液中施加20gs時長的電脈沖刺激使之融合，復合化學方法激活，從融合前恢復時間、融合電場強度、甘露醇濃度、激活前恢復時間、激活方式和

3、激活時間等六個方面著手研究了適宜延邊黃牛體細胞克隆的融合、激活條件，結果以融合率、卵裂率、異常率、4-6細胞發(fā)育率和8-16細胞發(fā)育率計。結果如下： (1)2.0h的融合前恢復培養(yǎng)時間能夠顯著提高融合的效率及質量，融合率和異常率分別為80.8％和16.6％。 (2)使用1100V/cm的融合電場強度后，4-6細胞和8-16細胞的發(fā)育率分別為61.9％，32.3％，顯著高于其它三組(P<0.05)。 (3)0.25

4、M、0.27M、0.30M的甘露醇濃度在融合率、卵裂率、異常率及重組胚發(fā)育率方面均不存在差異。 (4)激活前恢復培養(yǎng)20min和25min，重組胚的卵裂率為67.6％和71.6％，異常率為33.6％和29.3％，是延邊黃牛體細胞克隆理想的激活前恢復培養(yǎng)時間。 (5)采用離子霉素+6-DMAP的激活方式，重組胚卵裂率和8-16細胞發(fā)育率與其它三種方式沒有差異，異常率和2-4細胞發(fā)育率分別為26.6％和60.7％。

5、(6)激活培養(yǎng)4h，重組胚8-16細胞發(fā)育率為39.8％，顯著高于3h、6h組(P<0.05)，是延邊黃牛體細胞克隆的最適合激活時間。 使用SPSS14.0軟件對結果進行方差分析并多重比較后，綜合考慮實驗結果和方便操作時間與過程，得出以下結論：融合前恢復培養(yǎng)2h，采用0.30mol/L甘露醇作為融合液，在1100V/cm的電場強度下進行融合是適宜延邊黃牛體細胞克隆的融合條件；激活前恢復培養(yǎng)20-25min，使用離子霉素作為激活試