不同磷脂配比構(gòu)成的脂蛋白對(duì)J774細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)和SR-BI表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景：動(dòng)脈粥樣硬化（As）是一個(gè)多因素參與、多基因異常的疾病，以細(xì)胞內(nèi)膽固醇平衡失調(diào)、膽固醇代謝障礙為特征。泡沫細(xì)胞的形成是As的核心環(huán)節(jié)。膽固醇代謝失衡貫穿于泡沫細(xì)胞形成的整個(gè)過(guò)程。B類I型清道夫受體（scavenger receptor class B type I，SR-BI）是細(xì)胞膜上的一種清道夫受體，在動(dòng)脈硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能。SR-BI在肝臟中表達(dá)可促進(jìn)HDL膽固醇酯的選擇性攝取，由此被認(rèn)為在逆向膽

2、固醇轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用。高密度脂蛋白（HDL）可通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。有研究顯示：富含磷脂的HDL可以促進(jìn)細(xì)胞膽固醇流出，減少在細(xì)胞內(nèi)蓄積。而且重構(gòu)高密度脂蛋白顆粒中磷脂分子的物理性質(zhì)顯著影響顆粒清除細(xì)胞游離膽固醇的能力。 本研究意在探討不同磷脂配比重構(gòu)的脂蛋白對(duì)J774巨噬細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)和SR-BI表達(dá)的影響。 目的：研究不同磷脂配比構(gòu)成的脂蛋白rHDL-A1、rHDL-A2、rHDL-A3、rHDL-B

3、1、rHDL-B2對(duì)J774巨噬細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的影響；觀察不同磷脂配比脂蛋白rHDL-A1、rHDL-A2、rHDL-A3以及不同濃度的rHDL-A3對(duì)J774巨噬細(xì)胞SR-BI表達(dá)的影響。 方法：取新鮮抗凝血漿，用超速離心法進(jìn)行密度梯度離心，收集LDL、HDL3。將LDL置于含10μmol/LCuSO4的PBS溶液(pH7.2)中，37℃溫育24h；氧化修飾后的LDL置含200μmol/l EDTA的PBS中透析24h。將PO

4、PC、CE、Apo A-I、膽酸鈉按不同比例混合反應(yīng)生成脂蛋白，分別記為rHDL-A1、rHDL-A2、rHDL-A3、rHDL-B1、rHDL-B2。本實(shí)驗(yàn)分為三部分： 第一部分，研究rHDL-A1、rHDL-A2、rHDL-A3、rHDL-B1、rHDL-B2、HDL3對(duì)J774巨噬細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)有何影響。經(jīng)oxLDL預(yù)處理24小時(shí)的J774巨噬細(xì)胞分別加入rHDL-A1、rHDL-A2、rHDL-A3、rHDL-B1、rH

5、DL-B2、HDL3孵育16小時(shí)，用高效液相色譜分析法和液體閃爍計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)情況。 第二部分，主要檢測(cè)rHDL-A1、rHDL-A2、rHDL-A3對(duì)J774巨噬細(xì)胞SR-BI表達(dá)的影響：用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)SR-BI的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，用Western Blotting檢測(cè)SR-BI的蛋白表達(dá)。 第三部分，主要檢測(cè)不同濃度的rHDL-A3對(duì)J774巨噬細(xì)胞SR-BI表達(dá)的影響：用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)SR-BI

6、的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，用Western Blotting檢測(cè)SR-BI的蛋白表達(dá)。 結(jié)果： I. 高效液相色譜分析細(xì)胞內(nèi)膽固醇和膽固醇酯含量變化，oxLDL組、HDL3組、rHDL-A1組、rHDL-A2組、rHDL-A3組、rHDL-B1組、rHDL-B2組細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯與總膽固醇的比值分別為：49％，23％，39％，36％，32％，29％，24％（P<0.05）。說(shuō)明用不同含量磷脂重構(gòu)的脂蛋白處理oxLDL誘導(dǎo)過(guò)的J774巨噬

7、細(xì)胞CE/TC比值隨著磷脂含量的增加而減少；與oxLDL單獨(dú)處理的對(duì)照組相比，HDL3處理組與重構(gòu)脂蛋白處理組細(xì)胞CE/TC比值均有不同程度的降低，其中HDL3處理組最為明顯。液體閃爍計(jì)數(shù)法檢測(cè)J774巨噬細(xì)胞膽固醇流出情況：oxLDL對(duì)照組、HDL3組、rHDL-A1組、rHDL-A2組、rHDL-A3組、rHDL-B1組、rHDL-B2組，各組J774巨噬細(xì)胞膽固醇流出率分別為5.24％、26.59％、15.47％、18.66％、2

8、2.57％、20.36％、11.46％（P<0.05）。結(jié)果顯示：隨著 rHDL-A1、rHDL-A2、rHDL-A3中磷脂成分比例的增加，細(xì)胞膽固醇流出率也逐漸增加。 II．用RT-PCR和Western-Blotting方法檢測(cè)SR-BI的mRNA及蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：隨著磷脂組分所占比例的增加，rHDL- A1、rHDL-A2、rHDL-A3對(duì)J774細(xì)胞SR-BI表達(dá)呈逐漸上調(diào)趨勢(shì)； III. 用RT-PCR和W

9、estern-Blotting方法檢測(cè)SR-B1的mRNA及蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：rHDL-A3對(duì)J774細(xì)胞SR-BI表達(dá)呈濃度依賴性上調(diào)。 總結(jié)：不同含量磷脂的脂蛋白處理oxLDL誘導(dǎo)過(guò)的J774巨噬細(xì)胞CE/TC比值隨著磷脂含量的增加而減少；與氧化LDL對(duì)照組相比HDL3處理組與重構(gòu)脂蛋白處理組細(xì)胞CE/TC比值均有不同程度的降低，其中HDL3處理組最為明顯。隨著 rHDL-A1、rHDL-A2、rHDL-A3中磷脂成分比例