氧化修飾高、低密度脂蛋白對膽固醇合成及逆轉(zhuǎn)運基因SREBP-2和ABCA1表達的影響.pdf

1、動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種嚴重影響人類健康的疾病，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是其中危害最大的一種，特別是隨著我國老齡社會的到來，在我國冠心?。–oronary heart disease，CHD）的發(fā)病率和患病率日益增加。 膽固醇是生物體內(nèi)一種重要的脂類物質(zhì)，它一方面是生物膜的基本成分之一，另一方面又是膽汁酸、類固醇激素等多種生理活性物質(zhì)的原料。然而膽固醇濃度異常增高及其功能狀態(tài)的改變都可以導致增加

2、動脈粥樣硬化和心臟病的危險，因此機體內(nèi)膽固醇的濃度及正常生物活性應受到嚴格調(diào)控，以保證其正常生物功能發(fā)揮。 膽固醇的另一組分，高密度脂蛋白膽固醇亦會被氧化修飾成氧化型高密度脂蛋白（oxidized HDL，ox-HDL），當其成為ox-HDL后即和ox-LDL一樣具有較強的致動脈粥樣硬化作用，而失去其抗動脈粥樣硬化的保護作用。目前研究表明高密度脂蛋白對心血管系統(tǒng)具有保護作用，這種保護作用是通過細胞逆膽固醇轉(zhuǎn)運（Reverse C

3、holesterol Transport，RCT）機制來實現(xiàn)的，腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）是升高HDL-C及增加逆膽固醇轉(zhuǎn)運的關鍵基因，ABCA1在逆膽固醇轉(zhuǎn)運過程中把膽固醇成分逆轉(zhuǎn)運給HDL-C，再通過HDL-C組裝后經(jīng)血液循環(huán)到肝臟中代謝排除。本研究就試圖通過建立冠心病患者外周血來源巨噬細胞模型，然后給予不同濃度ox-HDL和ox-LDL干預，RT

4、-QPCR檢測巨噬細胞模型ABCA1mRNA表達變化，以初步探討ox-HDL和ox-LDL調(diào)控巨噬細胞ABCA1表達在致動脈粥樣硬化過程中的作用。 目的: 擬通過建立冠心病外周血單核細胞來源巨噬細胞模型，予以不同濃度的ox-LDL和ox-HDL進行干預，觀察不同濃度ox-LDL和ox-HDL影響下巨噬細胞中SREBP-2及ABCA1表達的改變，以探討ox-LDL和ox-HDL在冠心病發(fā)生發(fā)展中與SREBP-2和ABCA1

5、表達變化關系。 對象與方法: 1、對象: 根據(jù)中華醫(yī)學會2007年公布的《不穩(wěn)定性心絞痛和非ST段抬高心肌梗死診斷與治療指南》及2004年ACC/AHA公布的《ST段抬高心肌梗死診斷和治療指南》的診斷標準，經(jīng)病史、心電圖、心肌酶譜、肌鈣蛋白Ⅰ和冠脈造影確診為冠心病的患者共50例，其中男性26例，女性24例，平均年齡（60．12±8．36）歲；選擇經(jīng)詢問病史，體檢、實驗室檢查（血、尿、便常規(guī)、血脂、血糖、肝腎功能）

6、、心電圖、超聲心動圖、X線胸片及冠脈造影等檢查排除冠心病的正常對照組12例。其中男6例，女6例，年齡59．83±7．20歲。各組性別、年齡無顯著性差異（P>0．05）。研究對象知情同意，試驗方案通過倫理委員會鑒定。 2、方法: 2．1所有入選病例均行冠狀動脈造影檢查，根據(jù)冠狀動脈造影檢查結(jié)果并結(jié)合臨床癥狀、心電圖及心肌酶譜的變化隨機分為6組：（1）、正常對照組12例；（2）、無干預冠心病組10例；（3）、40mg/L o

7、x-LDL冠心病組10例；（4）、120mg/Lox-LDL冠心病組10例。（5）、40mg/L ox-HDL冠心病組10例；（6）、120mg/L ox-HDL冠心病組10例。嚴格登記入選病例一般資料：年齡、性別，血脂指標等。 2．2LDL、ox-LDL、HDL和ox-HDL的制備和鑒定：首先采用密度梯度超速離心法分離LDL和HDL。然后在含10μmol/LCuSO4的PBS溶液中37℃氧化至顏色由橙黃色轉(zhuǎn)為乳白色（6小時），

8、然后PBS溶液中透析純化，過濾除菌，BCA試劑蛋白定量，調(diào)蛋白濃度至1 g/L。聚丙烯酰胺凝膠電泳法鑒定ox-LDL和ox-HDL。 2．3單核細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定：在行冠狀動脈造影前，無菌操作下，從橈動脈或股動脈抽取動脈血20ml，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（PBMC）。在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)4小時后的單個核細胞，此時單核細胞貼壁，輕輕倒去上層未貼壁的淋巴細胞。收集部分單核細胞樣本進行臺

9、盼蘭拒染檢測細胞活力；通過單核細胞表面特異性標志分子CD14，利用流式細胞術檢測單核細胞的純度。 2．4單核源性巨噬細胞的培養(yǎng)和干預：各組培養(yǎng)的單核細胞用含終濃度為50 ng/ml的氟波脂（PMA）刺激48小時，使之大部分轉(zhuǎn)化為巨噬細胞。光學顯微鏡觀察單核-巨噬細胞。按步驟2．1隨機分組給予不同濃度ox-LDL及ox-HDL干預，原條件下培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育培養(yǎng)48小時。 2．5孵育培養(yǎng)48小時后，收集巨噬細胞，Trizol

10、法提取總RNA，總RNA提取產(chǎn)物采用紫外分光光度計檢測OD260/OD280比值，并用1．82%瓊脂糖凝膠電泳分析方法來確定RNA的量和純度。 2．6 SREBP-2和ABCA1基因序列來自PubMed，引物設計采用Primer Premier5．0引物設計件進行設計。熒光相對定量RT-QPCR法檢測不同試驗組巨噬細胞中SREBP-2和ABCA1的表達變化。對其擴增曲線進行記錄分析，采用△CT值進行統(tǒng)計學分析，采用2-（△△CT

11、）公式計算SREBP-2和ABCA1相對表達水平。 3、統(tǒng)計學處理 采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗結(jié)果計量資料以均數(shù)±標準差（x±SD）表示。計量資料多組間差異比較經(jīng)方差齊性檢驗后采用單因素方差分析（one-way ANOVA）；其中，滿足方差齊性的數(shù)據(jù)組間多重比較采用LSD法，不滿足方差齊性的多重比較方法采用Dunnett T3檢驗。P<0．05認為有顯著性差異。 結(jié)果: 1、不同組間

12、年齡、性別、比較差異均無統(tǒng)計學意義。冠心病組總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、LDL-C較正常對照組高，HDL-C較正常對照組低，各組差異有統(tǒng)計學意義，P值均小于0．05。冠心病各組間TC、TG、LDL-C和HDL-C無統(tǒng)計學差異。 2、成功分離出LDL和HDL，并成功制備氧化型脂蛋白。 3、成功培養(yǎng)外周血單核細胞來源巨噬細胞，細胞活力檢測活力大于95%。 4、無干預冠心病組和正常對照組比較，巨噬細胞中SREB

13、P-2和ABCA1 mRNA表達方面無顯著性差異。 5、40mg/L ox-LDL和ox-HDL干預冠心病組中巨噬細胞SREBP-2表達分別較對照組明顯增加，具有顯著性統(tǒng)計學差異（P<0．05）。120mg/L ox-LDL和ox-HDL干預冠心病組中SREBP-2表達分別與對照組相比較，無明顯的統(tǒng)計學差異（P=0．96）。40mg/L和120mg/L ox-LDL干預冠心病組，以及40mg/L和120mg/Lox-HDL干預冠

14、心病組間比較，巨噬細胞中SREBP-2表達量具有統(tǒng)計學差異（P<0．05）。 6、40mg/L ox-LDL干預冠心病組中巨噬細胞ABCA1表達較正常對照組明顯增加，有統(tǒng)計學差異（P<0．05）。120mg/L ox-LDL干預冠心病組中巨噬細胞ABCA1表達較對照組則明顯降低，有顯著性差異（P<0．05）。40mg/L和120mg/L ox-LDL干預冠心病組間比較有統(tǒng)計學差異（P<0．05）。 結(jié)論: 1、脂

15、質(zhì)代謝紊亂是動脈粥樣硬化的重要危險因素。 2、SREBP-2和ABCA1可能不是動脈粥樣硬化的獨立危險基因，動脈粥樣硬化的發(fā)病是多種危險因素長期綜合作用的結(jié)果。 3、氧化型LDL能影響SREBP-2和ABCA1 mRNA的表達。在低濃度ox-LDL干預下，SREBP-2表達有增加，這說明在動脈粥樣硬化早期ox-LDL可通過增加巨噬細胞SREBP-2介導的膽固醇合成代謝聚集大量的脂質(zhì)，從而導致動脈粥樣硬化的形成與發(fā)展。高濃

16、度的ox-LDL干預下，反而有降低SREBP-2的趨勢，這可能是由于高濃度ox-LDL對巨噬細胞產(chǎn)生嚴重的細胞毒性以及SREBP-2的負反饋調(diào)節(jié)有關。 在低濃度的ox-LDL可以上調(diào)ABCA1 mRNA的表達，這說明在動脈粥樣硬化早期細胞內(nèi)ABCA1表達代償性的增加，從而減少異常增多的ox-LDL攝入，促進細胞內(nèi)異常增多的ox-LDL排出。但是在高濃度的情況下，高濃度的ox-LDL并不能繼續(xù)上調(diào)ABCA1的表達，反而對ABCA1

17、的表達有明顯抑制作用，這可能是由于異常過高的脂質(zhì)毒性使ABCA1介導的膽固醇逆轉(zhuǎn)運作用受損，導致細胞內(nèi)異常脂蛋白的大量聚集，從而最終形成動脈粥樣硬化斑塊。 4、氧化型HDL同樣對SREBP-2和ABCA1 mRNA的表達有影響。低濃度的ox-HDL刺激增加了巨噬細胞中SREBP-2的表達，而抑制了ABCA1的表達；這種改變一方面與動脈粥樣硬化早期巨噬細胞對異常增加ox-HDL反應性有關，另一方面與SREBP-2激活后對ABCA1