PI3K信號通路對SR-BI在HepG2肝細(xì)胞動態(tài)轉(zhuǎn)移及HDL脂蛋白攝取的調(diào)節(jié).pdf

1、研究表明:血漿中低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平與動脈粥樣硬化(artherosclerosis，AS)的發(fā)病呈正相關(guān)，而高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平與AS的發(fā)病呈負(fù)相關(guān)。但是即使LDL-C降至極低的水平，殘余心血管疾病危險仍然存在，因此，除了過度強化極低LDL-C水平對心血管疾病

2、的重要性之外，如何提高HDL-C水平降低其他心血管危險因素成為人們越來越感興趣的治療目標(biāo)。關(guān)于HDL的研究主要有兩方面：一增加膽固醇逆轉(zhuǎn)運(reverse cholesterol transport，RCT)；二改善HDL的抗氧化、抗炎功能。而如何增加膽固醇逆轉(zhuǎn)運可能成為最有潛力的研究方向。HDL B族I型清道夫受體(scavenger receptor class B typeI，SR-BI)在RCT過程中起關(guān)鍵作用，研究表明SR-B

3、I基因表達(dá)增加，可以通過增加膽固醇逆轉(zhuǎn)運而減少動脈粥樣硬化，磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)主要通過參與細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)而激活下游信號通路。但是，PI3K的激活是否影響了SR-BI介導(dǎo)的HDL脂蛋白的攝取及SR-BI的功能和轉(zhuǎn)運尚不清楚，SR-BI的調(diào)節(jié)機(jī)制的研究可以為AS的防治提供新思路。
　　 研究目的：
　　 本課題擬構(gòu)建含SR-BI基因的重組腺相關(guān)病毒r

4、AAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP雜合載體，并轉(zhuǎn)染人HepG2肝細(xì)胞株，探討PI3K對SR-BI在肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及HDL-C脂蛋白攝取的調(diào)節(jié)，P13K是否可以通過調(diào)節(jié)SR-BI在肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及HDL-C脂蛋白攝取而影響膽固醇的逆轉(zhuǎn)運，為動脈粥樣硬化的防治提供新方法。
　　 研究方法：
　　 1、重組腺相關(guān)病毒的構(gòu)建：
　　 以pCMV. SPORT6-SR-BI質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增目的基因cDNA，將其克

5、隆至pSNAV2.0-IRES-EGFP-LacZa載體中，經(jīng)酶切及測序鑒定后，用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，經(jīng)G418篩選得到含SR-BI基因的BHK/SR-BI-IRES-EGFP載體細(xì)胞株，用攜帶rep2-capl基因的輔助病毒(rHsv/r2cl)感染該細(xì)胞株。通過細(xì)胞孵育、裂解和病毒純化，得到雜合載體rAAV2/1- SR-BI-IRES-EGFP病毒。
　　 2、rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP在He

6、pG2肝細(xì)胞的表達(dá)及對HDL脂蛋白攝取的影響：
　　 倒置免疫熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀測定rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP在HepG2肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率；細(xì)胞生長曲線觀察rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP轉(zhuǎn)染后對HepG2肝細(xì)胞增殖活性的影響；Realtime RT- PCR檢測轉(zhuǎn)染后SR-BI mRNA的表達(dá)；Western Blot檢測轉(zhuǎn)染后SR-BI蛋白的表達(dá)；125I-HDL同位素標(biāo)記觀察轉(zhuǎn)染對HD

7、L脂蛋白結(jié)合的影響。
　　 3、P13K信號通路對SR-BI在HepG2肝細(xì)胞動態(tài)轉(zhuǎn)移及HDL脂蛋白攝取的調(diào)節(jié)：
　　 Real-time RT-PCR方法觀察PI3K對HepG2肝細(xì)胞SR-BI基因表達(dá)的影響；Western Blot觀察PI3K對HepG2肝細(xì)胞SR-BI細(xì)胞總蛋白及膜蛋白表達(dá)的影響；125I-HDL同位素標(biāo)記技術(shù)觀察PI3K對rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP介導(dǎo)的HDL脂蛋白攝取的調(diào)節(jié)

8、；Western Blot觀察PI3K對HepG2肝細(xì)胞Akt及pAKt S-473總蛋白的表達(dá)的影響；激光共聚焦顯微鏡觀察PI3K對HepG2肝細(xì)胞SR-BI細(xì)胞轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)。
　　 統(tǒng)計分析
　　 用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組問均數(shù)的比較用單因素方差分析，有顯著差異者用LSD檢驗。P<0.05為差異有顯著性。
　　 研究結(jié)果：
　　 1、重組腺相關(guān)病毒的構(gòu)建：

9、r>　　 (1)利用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了pSNAV2.0-SR-BI-IRES-EGFP真核表達(dá)載體；將pSNAV2.0-SR-BI-IRES-EGFP在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，成功構(gòu)建了BHK/SR-BI-IRES-EGFP包裝細(xì)胞株。用攜帶AAV的rep2-capl基因的輔助病毒(rHsv/r2cl)感染已經(jīng)整合了SR-BI的BHK/SR-BI-IRES-EGFP載體細(xì)胞株，得到了攜帶有SR-BI基因的rAAV2/1-

10、SR-BI-IRES-EGFP載體純品。
　　 (2)經(jīng)PCR鑒定證實攜帶目的基因SR-BI的重組病毒
　　 rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP構(gòu)建成功。用SDS-PAGE電泳分析rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP病毒載體的純度在95％以上，用地高辛標(biāo)記的CMV探針點雜交方法檢測病毒液中rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP的物理滴度約1.5×1012vg/ml。
　　 2、rAA

11、V2/1-SR-BI-IRES-EGFP在HepG2肝細(xì)胞的表達(dá)及對HDL脂蛋白攝取的影響：
　　 (1)采用全新的重組腺相關(guān)病毒雜合載體rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP成功轉(zhuǎn)染人HepG2肝細(xì)胞，研究確定最佳MOI值為1×105，應(yīng)用此MOI值感染HepG2肝細(xì)胞72h感染效率可達(dá)85％，MTT法測定對細(xì)胞增殖活性無明顯影響。
　　 (2)分別采用Realtime RT-PCR2△△Ct相對定量方法及We

12、stern blot法測定轉(zhuǎn)基因后SR-BI mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組病毒rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP轉(zhuǎn)染組SR-BI mRNA水平較對照組增加9.78倍，SR-BI蛋白表達(dá)亦顯著增加，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。
　　 (3)與對照病毒rAAV2/1-IRES-EGFP轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組相比，重組病毒rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP轉(zhuǎn)染可以引起125I標(biāo)記的HDL脂蛋白與Hep

13、G2肝細(xì)胞的結(jié)合顯著增加，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。
　　 3、P13K信號通路對SR-BI在HepG2肝細(xì)胞動態(tài)轉(zhuǎn)移及HDL脂蛋白攝取的調(diào)節(jié)：
　　 (1)分別采用Realtime RT-PCR2-△△Ct相對定量方法及Western blot法測定P13K對SR-BI mRNA總蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明insulin及wortmannin均不能調(diào)節(jié)SR-BI基因及細(xì)胞總蛋白的表達(dá)。
　　 (2)應(yīng)

14、用Western blot測定結(jié)果表明insulin可以通過促進(jìn)Akt的磷酸化而促使HepG2肝細(xì)胞中SR-BI膜蛋白的表達(dá)增加，而wortmannin可以使insulin引起的SR-BI膜蛋白的表達(dá)增加下調(diào)，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。
　　 (3)應(yīng)用共聚焦顯微鏡觀察在無血清狀態(tài)下SR-BI同時位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，insulin及HDL均可以促進(jìn)SR-BI從細(xì)胞漿到細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)移，繼之引起HDL脂蛋白攝取的增加；而

15、wortmannin可以抑制insulin激動的SR-BI到細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)移。
　　 研究結(jié)論：
　　 1、利用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了攜帶SR-BI基因重組腺相關(guān)病毒rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP雜合載體。
　　 2、重組腺相關(guān)病毒rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP雜合載體可以安全、高效轉(zhuǎn)染人HepG2肝細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后目的基因及功能蛋白在入HepG2肝細(xì)胞株表達(dá)增加，能夠達(dá)到調(diào)控SR-BI