脂聯素對巨噬細胞膽固醇逆轉運的影響及其機制.pdf

1、當前，在全世界范圍內，心血管疾病的發(fā)病率和死亡率均位于前幾位，對人們的身心健康有著重大威脅。目前我國罹患心血管病者約2.3億人，其中約300萬人因該病死亡。在心腦血管病變中動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）為關鍵的病理基礎，以膽固醇代謝異常為主的脂質代謝紊亂是重要的致病因素；該疾病最主要的病理特點是巨噬細胞能清除高水平的脂質產生泡沫細胞?；谝陨媳尘埃芯空邆儫嶂杂谔接憚用}粥樣硬化病變的發(fā)生發(fā)展機制、怎樣避免形成泡沫細

2、胞。
　　膽固醇逆轉運（Reverse Cholesterol ransport，RCT）指的是把細胞中含有的游離性膽固醇向胞外轉移，并聚集至肝臟，最終排出機體；RCT全過程包括下列各步驟：最初外周細胞內含有大量膽固醇經轉運蛋白（如ABCA1和ABCG1等）的介導進而結合于載脂蛋白，生成成熟狀態(tài)的HDL，再隨著血液系統(tǒng)聚集到肝臟，最后排出機體。ATP結合盒轉運子(Binding Cassette Transporter，ABC)屬

3、于當前存在的數量最多的膜轉運家族。其中ATP三磷酸腺苷結合盒轉運子A1（ABCA1）是轉運時功能最突出的轉運蛋白，有助于細胞排出膽固醇。在ABCA1轉運蛋白的作用下脂質可發(fā)生外流，再結合于apoA-I，進而產生一定水平的磷脂-apoA-I復合物，并且能夠酯化細胞外游離狀態(tài)的膽固醇，最終可生成成熟狀態(tài)的HDL，隨著血液系統(tǒng)聚集在肝臟中，進而能夠被肝臟所利用而生成膽汁酸鹽，和糞便排出體外P[1-3]P P。所以，提升RCT水平有助于防止AS

4、病變。
　　相關的研究結果表明，高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein Cholesterol,HDL-C)數量與機體發(fā)生動脈粥樣硬化的可能性呈顯著的負相關關系。HDL-C拮抗動脈粥樣硬化的主要機制在于介導RCT過程。其中RCT能將外周組織內含有的大量膽固醇通過HDL-C轉運到肝臟以膽汁酸的形式排出體外，是目前相關領域研究者們公認的抗動脈粥樣硬化的關鍵機制。在RCT中ABCA1有利于細胞中磷脂、膽固醇向HD

5、L-C前體apoA-I轉運，形成新生HDL-C，進而啟動RCT，所以ABCA1在RCT和HDL-C新生成中起著極其重要的起始限速作用。所以能否通過調節(jié)ABCA1蛋白的表達而達到促進膽固醇逆轉運成為廣受關注的抗動脈粥樣硬化的靶點。
　　脂聯素(Adiponectin)主要來源于脂肪細胞，能夠發(fā)揮胰島素抵抗、抗動脈粥樣硬化及抗炎等作用。研究表明：在肥胖、高血壓、糖尿病、心肌受損、動脈粥樣硬化等病人血清內具有較低水平的脂聯素。并且，很多

6、臨床試驗結果顯示脂聯素濃度明顯降低與高血壓、血管內皮受損、冠心病及心肌梗死等病變的發(fā)生發(fā)展存在緊密的聯系[4]。在發(fā)生AS疾病的過程中，脂聯素能夠對血管平滑肌細胞的分化、繁殖進行抑制，并避免巨噬細胞不斷轉化為泡沫細胞，使脂聯素在內皮細胞中發(fā)揮抗AS功效。
　　脂聯素對巨噬細胞膽固醇逆轉運的影響及其機制在\在冠狀動脈粥樣硬化AS早期內皮細胞可被炎癥細胞激活在血管壁上沉積并呈劑量依賴性抑制TNF誘導的在人體主動脈內皮上的細胞粘附作用當

7、發(fā)生動脈硬化或其他大血管病變時大量的脂聯素會聚集在受損的血管壁上而導致患者脂聯素的消耗血漿脂聯素隨著動脈粥樣硬化的發(fā)展呈進行性下降低脂聯素血癥是冠狀動脈粥樣硬化發(fā)展的獨立危險因子脂聯素缺乏小鼠在動脈發(fā)生損傷的時候表現為嚴重的內膜增厚使用外源性脂聯素可使內膜增殖得到改善男性的脂聯素往往低于女性有人認為這可能是女性冠心病發(fā)病率低于男性的一個原因最近發(fā)生過心血管疾病患者脂聯素水平降低脂聯素每升高1μg/ml心血管的危險性則下降3％脂聯素可降低

8、腫瘤壞死因子TNF-α刺激的粘附分子的表達抑制外周單核細胞的生長和炎癥因子的釋放具有保護內皮抗炎拮抗動脈粥樣硬化的作用它的水平與甘油三酯載脂蛋白呈負相關與高密度脂蛋白及載脂蛋白A-I呈正相關。
　　本課題通過細胞水平和動物水平兩個部分來探討脂聯素對膽固醇逆轉運的影響。選擇脂聯素基因敲除小鼠(Adiponectin-/-GeneKnockOutMice)作為研究動物，連續(xù)8周堅持高脂飼養(yǎng)，建立動脈粥樣硬化模型。對脂聯素組動物血脂水平

9、改變情況進行檢測；小鼠注射3H-TC后，經液閃計數儀對脂聯素處理后動物肝臟、血清、糞便內含有的膽固醇流出量進行檢測；經Western-blot、PCR法對脂聯素處理后動物ABCA1的mRNA水平、蛋白量進行檢測，深入的分析脂聯素對RCT產生的影響和相關的作用機理，為臨床上有效的防止疾病的發(fā)生發(fā)展給予一個新方向、新思路。
　　1、脂聯素通過肝X受體α信號通路上調RAW264.7巨噬細胞中ABCA1、ABCG1的表達及意義
　　

10、目的：
　　離體研究脂聯素APN是否是通過肝X受體α信號通路影響RAW264.7源性泡沫細胞內含有的ABCA1、ABCG1表達的mRNA水平、蛋白量、膽固醇流出量、膽固醇總水平。
　　方法：
　　T培養(yǎng)RAW264.7巨噬細胞給予ox-LDL誘導為泡沫細胞。使用實時熒光定量PCR和westernblot檢測ABCA1、ABCG1mRNA和蛋白的表達；液體閃爍計數測定荷脂THP-1巨噬細胞和RAW264.7巨噬細胞內膽固

11、醇流出率；高效液相色譜法檢測細胞內膽固醇含量。
　　結果：
　　T脂聯素通過LXRα信號通路上調RAW264.7巨噬細胞中ABCA1、ABCG1表達。
　　結論：
　　脂聯素通過LXRα途徑提高RAW264.7巨噬細胞中的ABCA1、ABCG1表達和膽固醇流出。為預防和治療動脈粥樣硬化提供了理論基礎。
　　2、脂聯素對APN-/-動脈粥樣硬化小鼠ABCA1表達及動脈粥樣硬化的影響
　　目的：
　

12、　研究脂聯素對脂聯素基因敲除小鼠（APN-/-小鼠）體內巨噬細胞膽固醇逆轉運的影響及其在抗動脈粥樣硬化中可能的作用機制。
　　1.觀察脂聯素對ApoE-/-小鼠頸動脈粥樣硬化斑塊的作用；
　　2.探討脂聯素對斑塊內硝基化應激的作用及其可能機制；
　　3.觀察脂聯素對斑塊局部血流剪切力的影響,探討其抑制斑塊的其他可能機制。
　　方法：
　　1.模型建立：選擇4周齡脂聯素基因敲除小鼠（Adiponectin-/

13、-geneknockoutmice）30只，高脂喂養(yǎng)8周，建立動脈粥樣硬化模型。
　　2.分組：動物隨機分為五組：空白對照組，50μg/（kg·d）干預組，150μg/（kg·d）干預組，200μg/（kg·d）干預組，250μg/（kg·d）干預組。
　　3.方法：脂聯素干預4周后，向APN-/-小鼠腹腔注射乙?；疞DL與3H‐TC標記的RAW264.7巨噬細胞懸液，酶法測定小鼠血清血脂水平，液閃計數儀測定小鼠肝臟、血清及

14、糞便中3PH‐TC占腹腔注射P3PPH‐TC總量的百分比，RT-PCR及Western-blot檢測肝臟中ABCA1的mRNA及蛋白表達水平。
　　結果：
　　1.與對照組相比，脂聯素干預組血清TG、TC、LDL水平明顯降低，HDL升高；且此改變隨脂聯素呈劑量依賴性改變。
　　2.對照組主動脈粥樣硬化病變明顯，光鏡下可見血管壁有大量脂質沉積，有粥樣斑塊形成，有散在泡沫細胞；脂聯素干預組APN-/-小鼠的主動脈粥樣硬化病

15、變程減輕，且隨脂聯素呈劑量依賴性改變。
　　3.脂聯素干預組血清P3PPH‐TC含量明顯降低(P<0.05)，肝臟及糞便中PP3PH‐TC含量明顯升高(P<0.05)。
　　4.RT-PCR檢測結果顯示：與對照組相比，脂聯素干預組肝臟組織ABCA1的mRNA轉錄水平明顯提高，且隨脂聯素呈劑量依賴性增加(P<0.05)。
　　5.Western-blot結果顯示：與對照組相比，使用脂聯素干預的實驗組肝臟組織ABCA1的蛋

16、白表達水平明顯提高，且隨脂聯素呈劑量依賴性增加(P<0.05)。
　　結論：
　　1.脂聯素能夠降低血清TC、TG及LDL水平，提高HDL水平；
　　2.脂聯素可以減輕小鼠主動脈粥樣硬化；
　　3.脂聯素可以增加血清膽固醇流出率；
　　4.脂聯素能夠呈劑量依賴性上調肝臟組織中ABCA1的mRNA及蛋白表達。
　　脂聯素通過上調ABCA1來促進膽固醇逆轉運，促進細胞內膽固醇流出，從而延緩動脈粥樣硬化的發(fā)