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文檔簡介
1、樹突狀細胞(DC)是最重要的抗原提呈細胞,指導CD4+T細胞的活化和分化,參與調節(jié)機體全身免疫反應。當機體受到病原感染時,DC通過其模式識別受體感知外來病原導致其成熟和活化。活化的DC提呈抗原給CD4+T細胞誘導其活化和分化。分化的CD4+T細胞根據(jù)其分泌細胞因子的不同可以分為Th1、Th2和Th17細胞亞群。Th1細胞主要分泌IFN-γ保護機體免受胞內病原感染;Th2細胞分泌IL-4、IL-5和IL-13等細胞因子介導體液免疫抗寄生蟲
2、感染;Th17細胞主要分泌IL-17抵抗胞外真菌感染和參與自身免疫性疾?。ㄈ鏓AE)的發(fā)生發(fā)展。因此分化的CD4+T細胞對于機體抵抗外米病原感染具有十分重要的意義,目前研究的較為清楚的是T細胞內部的信號通路和轉錄因子是如何調節(jié)CD4+T細胞分化的,關于DC如何調控CD4+T細胞分化的分子機制還不是十分清楚。
C型凝集素受體(CLRs)是指在其胞外區(qū)含有CRD(carbohydrate recognitiondomain)結構域
3、的一類蛋白分子,主要表達在髓樣細胞,它們在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著多種重要的作用。CLRs可以通過識別真菌細胞壁上的糖基或直接誘導DC胞內信號通路活化或協(xié)同TLRs介導的信號調節(jié)免疫反應?,F(xiàn)在已有的研究證明CLRs主要誘導Th17細胞的分化。
LSECtin(肝臟和淋巴結竇內皮細胞粘附分子)是本實驗室從肝臟中發(fā)現(xiàn)的C型凝集素受體。前期研究結果表明:LSECtin特異表達于肝臟的竇內皮細胞(半抗原提呈細胞)和Kupffer細胞(器官特異
4、性巨噬細胞),識別活化T細胞表面的未知配體,負調節(jié)T細胞活化,從而抑制刀豆蛋白A(ConA)誘導的急性肝炎的發(fā)生發(fā)展。這些結果說明LSECtin在肝臟局部免疫反應中發(fā)揮重要作用。肝臟是機體內.的免疫豁免器官,在其內發(fā)生的免疫反應趨向于耐受狀態(tài),這與以血液和骨髓為主體的全身免疫反應存在不同。由骨髓細胞分化而來的樹突狀細胞在全身免疫反應中發(fā)揮重要作用,是連接天然免疫反應和適應免疫反應的橋梁。
本論文中,首先研究在骨髓衍生的樹突狀細
5、胞(BMDC)是否表達LSECtin。實驗結果顯示BMDC上表達LSECtin。在不同時間點應用LPS、IFN-γ、IL-4和TGF-β等不同刺激物處理BMDC,發(fā)現(xiàn)只有TGF-β處理的BMDC在各個時間點均一致性的下調BMDC上LSECtin的轉錄,說明TGF-β負調節(jié)LSECtin的表達。
為了進一步研究BMDC上表達LSECtin的功能,我們應用OVA抗原刺激BMDC和T細胞共培養(yǎng)體系。與LSECtin+/+BMDC相比
6、,LSECtin-/-BMDC不影響CD4+T細胞增殖,但是LSECtin-/-BMDC抑制了CD4+T細胞分泌IFN-γ(Th1細胞的標志性細胞因子)和IL-17的分泌(Th17細胞的標志性細胞因子),而促進了IL-13(Th2細胞的標志性細胞因子)的分泌。CD4+T細胞內表達的轉錄因子T-bet、RORγ和RORα、GATA3分別控制IFN-γ、IL-17和IL-13的轉錄。我們的研究發(fā)現(xiàn)LSECtin-/-BMDC顯著抑制T-be
7、t、RORγ和RORα在mRNA水平的轉錄,同時促進GATA3的轉錄。CD4+T細胞表面表達的IL-12受體和IL-6受體/IL-23受體介導的胞內信號通路調節(jié)T-bet、RORγ和RORα的轉錄。發(fā)現(xiàn)LSECtin+/+和LSECtin-/-BMDC的IL-12受體和IL-6受體/IL-23受體的表達不存在差異,說明LSECtin-/-BMDC抑制T-bet、RORγ和RORα的轉錄并不是因為抑制IL-12受體和IL-6受體/IL-2
8、3受體的表達導致的。
DC分泌的IL-12p70和IL-6/IL-23分別是誘導CD4+T細胞向Th1和Th17分化的關鍵性細胞因子。研究進一步發(fā)現(xiàn),在DC和T細胞的共培養(yǎng)體系中,LSECtin缺失后抑制了IL-12p70、IL-6和IL-23分泌。而在共培養(yǎng)體系中添加IL-12p70或IL-6確實能夠挽救由于LSECtin缺失引起的Th1或Th17分化缺陷。
BMDC細胞表面表達很多的共刺激分子,其中CD11c、C
9、D40、CD80和MHC-(Ⅱ)(I-A/I-E)的表達對于T細胞的分化非常重要,但是LSECtin+/+和LSECtin-/-BMDC表達的這些共刺激分子并沒有差異。此外,在OVA抗原刺激下,LSECtin+/+和LSECtin-/-BMDC分泌的細胞因子也并沒有差異。而且與共培養(yǎng)體系相比,OVA抗原刺激BMDC后細胞因子的分泌量也非常低。因此,實驗結果說明在共培養(yǎng)體系中,LSECtin促進IL-12p70、IL-6和IL-23的分泌
10、依賴于CD4+T細胞的存在。前期研究結果表明,CD4+T細胞表面有LSECtin的未知配體,所以這些結果強烈暗示T細胞表面的LSECtin內源性配體,通過LSECtin反向作用于DC,促進DC分泌細胞因子,從而誘導Th1和Th17細胞的分化。
為了證實這個假設,應用LSECtin不同的單克隆抗體(CCA023、CFD051和CCB059)模擬LSECtin的配體刺激DC。LSECtin單克隆抗體CCA023、CFD051和CC
11、B059分別識別LSECtin的跨膜區(qū)、脖子區(qū)和糖基識別結構域(CRD)。研究發(fā)現(xiàn)只有CFD051刺激DC后能夠誘導細胞因子TNF-α的分泌,說明LSECtin能夠誘導DC分泌細胞因子,并且特異的被識別脖子區(qū)的CFD051抗體所觸發(fā)。為了進一步研究LSECtin對DC功能的影響,DC分別接受培養(yǎng)基培養(yǎng)、mIgG1同型對照和CFD051抗體刺激,12h后,發(fā)現(xiàn)051抗體刺激后MDDC的樹突樣結構明顯增加,這說明LSECtin誘導DC成熟(
12、形態(tài)學水平)。為了進一步在分子水平驗證LSECtin促進DC成熟,分別應用mlgG1同型對照、CFD051抗體和LPS刺激(陽性對照)DC,24h后,檢測共刺激分子HLA-DR、CD83和CD86的表達。發(fā)現(xiàn)CFD051抗體刺激后,這些DC的共刺激分子表達明顯上調,因此可以證實LSECtin促進DC成熟。此外,更重要的是我們需要證明DC上表達的LSECtin促進細胞因子的分泌,例如IL-6。應用不同濃度的mIgG1同型對照和CFD051
13、抗體刺激DC,24h后,ELISA檢測細胞因子IL-6和IL-10分泌。發(fā)現(xiàn)CFD051抗體促進DC分泌IL-6和IL-10,并且分泌量與LSECtin的抗體濃度呈現(xiàn)劑量依賴性。同樣,應用相同濃度的mIgG1同型對照和CFD051抗體處理DC,在不同時間點收獲DC,檢測CFD051抗體對細胞因子IL-6、TNF-α和IL-10轉錄的影響。發(fā)現(xiàn)在3h時,CFD051抗體誘導細胞因子IL-6、TNF-α和IL-10轉錄達到高峰。總之,以上這
14、些結果充分說明DC上表達的LSECtin通過與LSECtin單克隆抗體CFD051的結合促進DC的成熟和分泌細胞因子,暗示CFD051是通過誘導LSECtin胞內信號的活化影響DC的功能。
為了研究LSECtin介導胞內信號轉導活化的機制,首先分析了LSECtin的氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)在其胞內并不存在信號轉導所需的ITAM基序(immunoreceptor tyrosine-based activatory motif),但是在靠
15、近其跨膜區(qū)附近有一段富含帶正電荷的氨基酸序列WXYWXYWXYY(X代表任意氨基酸,Y代表帶正電荷氨基酸)。帶正電荷的氨基酸可以與帶有負電荷的接頭蛋白(DAP12和FceRIg)相互作用,傳遞信號。通過免疫共沉淀實驗,我們證明LSECtin不與接頭蛋白分子FceRIg存在相互作用,但是與DAP12存在相互作用,而且這種相互作用依賴于LSECtin的跨膜區(qū)。此外通過慢病毒感染Jurkat細胞共轉LSECtin和DAP12,我們發(fā)現(xiàn)DAP1
16、2促進LSECtin細胞表面的穩(wěn)定表達,初步說明LSECtin和DAP12的相互作用是功能性的。上述結果提示LSECtin可能通過與DAP12相互作用,借助DAP12胞內區(qū)的ITAM基序(免疫酪氨酸活化基序)誘導胞內信號的發(fā)生。
綜上所述,研究結果顯示:T細胞表面的LSECtin未知配體作用于DC上的LSECtin,通過DAP12誘導胞內信號的發(fā)生,促進IL-12p70和IL-6/IL-23等細胞因子的分泌,進而誘導初始CD4
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