人類基因組CpG島文庫的構(gòu)建和抑制物控制性PCR的建立與應(yīng)用.pdf

1、目的 1.建立分離和富集人類基因組CpG島(CpGislands，CGIs)的甲基化敏感性鏡像定位選擇(methylation-sensitivemirrororientationselection，MS-MOS)方法，并將MS-MOS產(chǎn)物制備成CGIs文庫。 2.建立抑制物控制性PCR(inhibitor-controlledPCR，IC-PCR)方法，并系統(tǒng)地探討內(nèi)對照處理(internalprocessingcon

2、trol，IPC)與目的DNA之間的相互作用關(guān)系，同時，將IC-PCR應(yīng)用于比較分析多種不同DNA抽提方法降低或消除豬源性肝素粗制品(industrialcrudeporcineheparin，ICPH)中的PCR抑制物的能力。 3.分析不同核酸熒光染料在瓊脂糖凝膠電泳中的染色特性，找到一種比EB更安全的核酸熒光染色法。 方法 1.MS-MOS方法的建立和CGIs文庫的制備 1.1MS-MOS分離和富集人

3、類基因組CGIs 1.1.1樣本DNA(testerDNA，T-DNA)和驅(qū)動DNA(driverDNA，D-DNA)的制備：男性基因組經(jīng)MseⅠ酶切后與H24接頭連接，一部分連接產(chǎn)物經(jīng)連接介導(dǎo)性PCR(ligation-medicatedPCR，LM-PCR)制備成preT-DNA，另一部分連接產(chǎn)物則經(jīng)HpaⅡ/HhaⅠ雙酶切后再經(jīng)LM-PCR制備成preD-DNA。preT-DNA和preD-DNA經(jīng)MseⅠ酶切分別制備成T

4、-DNA和D-DNA。 1.1.2CGIs的分離和富集：應(yīng)用鏡像定位選擇(mirrororientationselection，MOS)分離和富集只存在于T-DNA的非甲基化CGIs(nonmethylatedCGIs，UM-CGIs)，并以Spike消減為陽性對照，自身消減和反向消減為陰性對照。 1.2CGIs文庫的制備與鑒定 正向消減的MS-MOS產(chǎn)物以TA克隆方式轉(zhuǎn)化至E.ColiXL1-BlueMRF'制

5、備成CGIs文庫。通用引物PCR(universalprimerPCR，UPPCR)鑒別CGIs文庫克隆是否存在插入片段及其大小分布特征，并隨機挑選部分克隆測序，然后分別利用相關(guān)軟件和核酸數(shù)據(jù)庫確定各個克隆插入片段的序列特征。最后，采用甲基化敏感限制性內(nèi)切酶PCR(methylation-sensitiverestrictionendonucleasesdigestionPCR，MSRE-PCR)確定陽性克隆的CGIs在正常細(xì)胞中的甲基

6、化狀態(tài)。 2.IC-PCR方法的建立和應(yīng)用 2.1IC-PCR方法的建立：分別以牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)為PCR擴增促進(jìn)劑，以來源于人類基因組p16的IPC前體(pre-IPC)制備IPC，通過分析BSA降低或消除肝素的PCR抑制物活性，以及IPC與目的DNA之間的擴增依賴關(guān)系，最終確定IC-PCR的最佳反應(yīng)條件。 2.2IC-PCR的應(yīng)用：分別采用不同的方法抽提富含肝素的IC

7、PH的DNA，然后用IC-PCR來評價和比較各種DNA抽提方法降低或清除ICPH中PCR抑制物的能力。 3.不同核酸熒光染料在瓊脂糖凝膠電泳中的染色特性比較分析 將EB、GoldViewTM、SYBR(R)GreenⅠ和SYBR(R)Gold分別按照不同的方法加至瓊脂糖凝膠，然后比較和分析同一種DNA大小標(biāo)準(zhǔn)品在不同染料中的染色特性。 結(jié)果 1.MS-MOS可在基因組水平分離和富集CGIs，正向消減的MS

8、-MOS產(chǎn)物經(jīng)TA克隆制各成CGIs文庫。 1.1MS-MOS分離和富集人類基因組CGIs 1.1.1T-DNA和D-DNA的制備：T-DNA和D-DNA條帶分布寬度為200-2,000bp，并主要分布于250-1,000bp，與人類基因組CGIs大小主要分布范圍(200-1,000bp)一致；T-DNA和D-DNA的均一性鑒定結(jié)果表明，UM-CGIs只存在于T-DNA，甲基化CGIs(methylatedCGIs，M-

9、CGIs)和非CGIs(non-CGIs，Non-CGIs)則同時存在于T-DNA和D-DNA。 1.1.2CGIs的分離和富集：正向消減表現(xiàn)為大于300bp的多條獨立電泳條帶，Spike消減(陽性對照)的電泳條帶背景清晰，自身消減(陰性對照)和反向消減(陰性對照)的電泳條帶僅有微弱可見帶，結(jié)果說明MS-MOS的消減能力至少達(dá)到了0.01％。 1.2CGIs文庫的制備與鑒定 CGIs文庫克隆插入片段的平均大小為6

10、27bp，CGIs文庫的豐度為6.0-8.0×104，其中，CGIs的陽性克隆占32.5％，屬于重復(fù)序列的克隆占55.0％，其它克隆占12.5％。重復(fù)序列的克隆中，大部分(72.7％)是以CAATC類為主的衛(wèi)星序列，其余部分(27.3％)則全部是LINE。在排除重復(fù)克隆的基礎(chǔ)上，CGIs文庫中屬于或含有單拷貝CGIs的陽性克隆有12,000-16,000個，占人類基因組非重復(fù)序列CGIs預(yù)測總數(shù)(28,890)的41.5-55.4％。M

11、SRE-PCR的鑒定結(jié)果表明，陽性克隆的CGIs在正常細(xì)胞中均是UM-CGIs。 2.IC-PCR是監(jiān)測PCR體系中是否存在PCR抑制物，避免假陰性結(jié)果的有效方法。 2.1IC-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化：BSA只有在其工作濃度為0.01％時才能最有效地降低肝素的PCR抑制物活性；IPC與目的DNA兩者的擴增成一種濃度劑量依賴關(guān)系，只有當(dāng)每25μl反應(yīng)體系的IPC≤10fg時，IPC的擴增才不會影響目的DNA的擴增。

12、2.2IC-PCR的應(yīng)用：不同的DNA抽提方法降低或消除ICPH中的PCR抑制物的能力各不相同，其中，只有瓊脂糖膠純化法才能完全消除ICPH中的PCR抑制物活性。 3.SYBR-LB1和SYBR-LB2染色法比EB染色法更經(jīng)濟(jì)和更安全。 盡管EB對于≤100bpDNA條帶靈敏度高于其它三種熒光染料，但是，SYBR-LB1和SYBR-LB2的染色特性已適合常規(guī)PCR產(chǎn)物的鑒定。SYBR-LB1和SYBR-LB2染色法中，D

13、NA片段的電泳遷移率依賴于染料或DNA濃度，使其在實際應(yīng)用中受到了一定程度的限制。 結(jié)論 1.MS-MOS是分離和富集人類基因組CGIs的有效新方法，基于該方法制備的人類基因組CGIs文庫具有較高比例的陽性克隆。MS-MOS的建立及CGIs文庫的制備有利于今后進(jìn)一步在基因組水平研究CGIs甲基化狀態(tài)和模式，篩選與腫瘤表觀遺傳學(xué)異常機制相關(guān)的抑癌基因或新基因。 2.在IC-PCR反應(yīng)體系中，為了避免IPC對目的DN

14、A擴增的干擾，IPC的在反應(yīng)體系中的工作濃度必須優(yōu)化。此外，作為PCR擴增促進(jìn)劑的BSA的最佳工作濃度也必須優(yōu)化。IC-PCR應(yīng)用于ICPH的7種DNA抽提方法的比較分析結(jié)果表明，IC-PCR是可監(jiān)測反應(yīng)體系中是否存在PCR抑制物，從而避免假陰性結(jié)果的有效方法。IC-PCR方法的建立為PCR應(yīng)用于各種可能存在PCR抑制物的臨床和科研標(biāo)本的檢測提供了一種可選的新方法。 3.分別來自SYBR(R)Gold和SYBR(R)GreenI